上一期小編已在《【經驗分享】細胞培養如何避免支原體感染》一文中簡單介紹細胞培養過程中的支原體汙染，現在就跟大家探討一下怎樣判斷和防止細胞在培養中出現汙染。
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微生物主要通過下面途徑進入培養體系，造成汙染。
1)空氣是微生物傳播的主要途徑。空氣流動性大，如果培養操作界面與外界隔離不嚴格或消毒不充分，外界空氣很容易進入培養體系而造成汙染。所以，培養設施不能設在通風場所，無菌操作應在超淨工作檯內進行，工作時要戴口罩，以免因講話、咳嗽等使外界汙染進入工作面，造成汙染。
2) 各種培養器皿、器械消毒不徹底、洗刷不乾淨可導致汙染。
3)操作中若無菌意識不強、技術不熟練、操作不規範、使用汙染的器皿，可造成汙染。當培養兩種以上細胞時，交叉使用吸管或培養液、培養瓶可能導致細胞之間交叉汙染。
4)血清在生產時已經被支原體或病毒汙染，變成了汙染源。
5) 原代培養的汙染多數來源於組織樣本本身。
體外培養的細胞本身沒有抵抗汙染的能力，細胞一旦汙染意味著這次培養失敗。當汙染程度較輕時，如果能及時去除汙染物，部分細胞還能恢復。如果汙染物一直存在，細胞生長變得緩慢，分裂次數逐漸減少，細胞的輪廓增強，細胞質出現顆粒。嚴重的時候細胞停止生長和分裂，細胞質中堆積很多小顆粒，細胞變得很圓，直至細胞死亡。
怎樣判斷細胞受細菌汙染呢？
常見的汙染細菌包括大腸桿菌、葡萄球菌等。當培養細胞懷疑受細菌感染的時候，取10 mL細胞懸液以1000 r/min離心5 min，用無菌的緩衝液清洗2次，在沉澱中加入2 mL不含抗生素的培養液，37℃下培養。
如果細胞真的被細菌汙染，24 hr內就可獲得陽性結果。當汙染的細菌量比較大或細菌增殖到一定基數時，大約每20分鐘增一代，培養體系內的大量細菌可快速消耗培養體系中的養分，同時釋放大量代謝產物。數小時後可憑肉眼就可看到培養液變得渾濁。如細菌含量較大，代謝產物可使培養液變為黃綠色，用相差顯微鏡觀察，可見全視野都是細菌顆粒，清晰的培養背景變得模糊，大量細菌可覆蓋細胞，直接威脅細胞的生存。
可用青黴素、鏈黴素雙抗可有效預防細菌汙染。
如果細胞被真菌感染了，怎麼判斷呢？
多數真菌會長出菌絲和孢子，交織在一起。而且呈白色或淺黃色小點漂浮在培養液表面上，或以絮狀物漂浮在培養液中或附著在培養皿表面。有些則分散生長，鏡下可見呈絲狀、管狀、樹枝狀，縱橫交錯穿行於細胞之間，汙染了黴菌的培養液中可見到白色絲狀團塊。真菌生長迅速，短時間內能降低培養液的pH並抑制細胞生長，能產生有毒物質殺死細胞。一旦出現汙染，真菌還通過培養瓶的孔隙間傳播，交叉汙染。
抗真菌製劑可有效防止和排斥真菌汙染。
那怎樣判斷支原體汙染呢？
支原體汙染是細胞培養中最常見的幹擾試驗結果的一種汙染。鏡下不易觀察，培養液不渾濁。在早期發現支原體的汙染很困難，一般情況下，當在顯微鏡下觀察，培養的細胞碎片較多，並且要頻繁更換營養條件才能長期支持傳代培養時，應懷疑已經受汙染，可通過DNA螢光染色、PCR、免疫學方法等手段進一步判斷。
小編認為比較可靠的判斷方法，一是用螢光免疫法觀察，使用Hoechst33258螢光染料，它使支原體的DNA著色。二是用掃描電鏡或透射電鏡觀察。三是將5毫升細胞懸液加入45毫升支原體肉湯培養基，培養14天觀察肉湯培養有沒有出現霧狀沉澱，再取500微升細胞懸液至50℃培養基，用瓊脂培養基做分離培養，37℃培養3天觀察是否出現類似「荷包蛋」菌落。
支原體汙染細胞，特別是很珍貴或難取的細胞株，必須要清除支原體。常用的方法包括抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補體聯合處理。支原體最突出的結構特徵是沒有細胞壁，對作用於細胞壁生物合成的抗生素完全不敏感。對支原體有較強的抑制活性及常用於支原體感染治療的抗生素是四環素類、大環內酯類、一些氟喹諾酮。
總的來說，預防汙染是非常關鍵的，才能使實驗順利進行。那怎樣預防細胞受汙染呢？
用於細胞培養的器皿要求很高，一定要清潔得當，清洗完一定要滅菌，做到真正的無菌。
在操作之前，按照機器型號的相應規定，定期清洗或更換超淨工作檯或生物安全櫃的空氣濾網，請專業人員定期檢查超淨工作檯的空氣淨化標準；注意培養器皿的消毒情況，是否標示清楚，有條件的實驗室可使用一次性細胞培養用品；檢查新配製的培養液，確認無菌才能使用；操作前30分鐘啟動超淨工作檯的紫外燈消毒，照射半小時後方可進行實驗操作；操作時要戴口罩和一次性手套，注意消毒。
在操作中，放置在超淨臺上的所有培養用品包括培養器皿的瓶口不能與風口相逆，應注意保護瓶口，避免讓器皿直立敞口直接暴露在操作臺。不允許用手觸及器皿的無菌部分，如瓶口和瓶塞的內測。在開啟或封閉瓶口時要經過酒精燈燒灼，並在火焰附近工作；吸取培養液和細胞懸液時，應該專管專用，以防止汙染擴大或造成培養物的交叉汙染（最好是只在超淨臺上處理一種細胞）。使用培養液前，不要過早開啟瓶口，應先將瓶口擰松，以便單手操作。使用完培養液後要立即過火焰封口（最好用封口膜完全封口）。培養的細胞在操作前不要過早暴露在空氣中。操作過後將工作檯整理好，並用75%乙醇擦拭臺面，紫外燈照射30分鐘。
另外，要儘早凍存有價值的培養物。購入的未滅活血清要採取56℃水浴滅活30分鐘，以滅活血清中的補體和支原體；為了避免誘導產生耐藥細菌，要定期更換抗生素，或儘可能少用抗生素。還要密切觀察新購入的細胞株，防止外來的汙染源。
本期就介紹到這裡，大家如果對細胞培養有任何疑問，歡迎在下面評論區留言。
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