如何拯救你 那些被汙染的細胞

　　汙染是細胞培養的大敵。預防和避免汙染是細胞培養成功的關鍵之一。一開始就要十分重視，防止汙染，否則會前功盡棄，不僅浪費時間，而且浪費人力、物力，甚至造成無法彌補的損失。

　　(一)汙染的類型

　　細胞培養過程中的汙染不僅僅指微生物，而且還包括所有混入培養環境中的、對細胞生存有害或造成細胞不純的物質，包括生物和化學物質。

　　1、細菌汙染

　　細菌汙染是實驗室細胞培養中常見的汙染，即使在細胞培養液中加入了抗菌素，也可能因為操作不慎而引起汙染。最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。

　　培養細胞受細菌汙染後，會出現培養液變混濁，pH改變。汙染後細胞發生病理改變，胞內顆粒增多、增粗，最後變圓脫落死亡。

　　2、真菌汙染

　　真菌汙染是細胞培養過程中最常見的一種，最常見的真菌有煙麴黴、黑曲菌、孔子黴、毛黴菌、白色念珠菌和酵母菌。

　　培養細胞受真菌汙染後，可見培養液中漂浮著白色或淺黃色的小點，有的散在生長，培養液一般不發生混濁;倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養基中，有的呈鏈狀排列。

　　真菌汙染後，細胞生長變慢，但最後由於營養耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。

　　

絲狀菌汙染

　　3、支原體汙染

　　支原體是介於細菌與病毒之間能獨立生活的最小微生物，最小直徑0.2μm，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態結構。開始不易發現，能在偏鹼條件下生存，對青黴素有抗藥性。多吸附於細胞表面或散在於細胞之間。

　　培養細胞受支原體汙染後，部分敏感細胞可見細胞生長增殖變慢，部分細胞變圓，從瓶壁脫落。但多數細胞汙染後無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產生交叉汙染。

    

陽性                    陰性

　　4、病毒汙染

　　組織細胞培養過程中，如果沒有除去潛在的病毒，就會產生病毒汙染。目前，從原代猴腎細胞的培養中已發現不少於20種血清性病毒。

　　儘管病毒汙染的細胞不影響原代培養，但生產疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細胞大量生產和疫苗、幹擾素等生物製品製作中的難題。

　　5、非同種細胞汙染

　　由於細胞培養操作時各細胞株所需的器材和溶液沒有嚴格分開，往往會使一種細胞被另一種細胞汙染。目前，世界上已有幾十種細胞都被HeLa細胞所汙染，致使許多實驗宣告無效。

　　非細胞培養物所造成的化學成分的汙染也偶有發生，大多是由於細胞培養所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學物質所致。

　　(二)汙染的鑑別

　　1、細菌、真菌汙染的檢測

　　(1)肉眼觀察

　　細菌、真菌汙染常在傳代、換液、加樣等開放性操作之後發生，而且增生迅速，若有汙染，在48小時內可明顯觀察到，例如培養液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起。

　　(2)接種觀察

　　採用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養液接種，也可發現是否有汙染。

　　(3)鏡下觀察

　　在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細菌汙染。

　　若細胞之間有絲狀、管狀、樹枝狀或卵形的物質常為真菌汙染。

　　2、支原體汙染的檢測

　　(1)相差顯微鏡觀察

　　直接取少許培養液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察，支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位於細胞與細胞之間，有時可見類似於布朗運動的表現。應注意與細胞破碎溢出的內容物如線粒體等相區別。

　　(2)螢光染色法觀察

　　用螢光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結合，可使支原體內的DNA著色，螢光顯微鏡下支原體呈綠色小點，散在於細胞周圍或附於細胞表面。

　　(3)電鏡檢測

　　若條件許可，可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細胞培養48～72小時，細胞接近匯合前，用胰酶消化細胞製成細胞懸液後進行固定、包埋、切片後才能進行觀察。

　　

支原體掃描電鏡圖片

　　(4)培養檢測

　　將細胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養基，培養14天後觀察肉湯培養有無霧狀沉澱，然後取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養基中，再用瓊脂培養基做分離培養，37℃培養3天觀察有無「荷包蛋」菌落出現。

　　3 、病毒的檢測

　　1) 應用電鏡技術快速診斷動物病毒病

　　

冠狀病毒電鏡圖

　　2) 逆轉錄_聚合酶鏈反應RT_PCR檢測病毒

　　(三)汙染的清除

　　培養細胞一經汙染，多數較難處理。如果汙染細胞價值不大，宜棄之;在尋找原因後徹底消毒操作室，復甦或重新購置細胞，再培養。

　　若汙染細胞價值較大，又難於重新得到，可採取以下辦法清除。

　　一、細菌和真菌的清除

　　1、使用抗生素

　　抗生素對殺滅細菌較有效。聯合用藥比單獨用藥效果好。預防用藥比汙染後再用藥效果好。預防用藥一般用雙抗生素，汙染後清除用藥需採用大於常用量5～10倍的衝洗法，於加藥後作用24～48小時，再換常規培養液。此法在汙染早期有效。

　　二、支原體的清除

　　1、用MRA處理

　　用MRA(Mycoplasma Removal Agent)處理細胞，每4天換一次液,連續處理15天以確保細胞純潔健康，效果好.

　　2、用清洗純化法清除支原體汙染的方法

　　細胞營養馴化→優質細胞群的篩選→細胞清洗→反覆離心洗滌

　　其原理是利用離心力、細胞、微生物質量和懸液的浮力差達到清除支原體的目的。由於支原體個體小且除發酵支原體外多為細胞外寄生,所以通過反覆洗滌細胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數量降低至極限。

　　如結合敏感抗生素的抑殺作用，可達到更好的效果。

　　3、藥物輔助加溫處理

　　先用藥物處理後，再將汙染的組織培養物放在41℃培養18小時，可殺死支原體，但對細胞有不良影響。

　　4、使用支原體特異性血清

　　用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體汙染，因特異抗體可抑制支原體生長，故經抗血清處理後11天即轉為陰性，並且5個月後仍為陰性。但此法比較麻煩，不如用抗生素方便、經濟。

　　(四)、汙染的預防

　　預防是防止細胞培養過程中發生汙染的最好辦法。只有預防工作做在前，才能將發生汙染的可能性降到最小程度。

　　一般預防可從以下幾方面著手：

　　1、添加抗生素

　　2、從物品、用品消毒滅菌著手

　　細胞培養所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細，並在無菌試驗陰性後才能使用。

　　操作室及剩餘的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。

　　3、從操作者做起

　　(1)進無菌室前要用肥皂洗手，按規定穿隔離衣。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。

　　(2)操作者動作要輕，必須在火焰周圍無菌區內打開瓶口，並將瓶口轉動燒灼。操作時儘量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應轉向背面。

　　(3)操作時要常更換吸管，一旦發現吸管口接觸了手和其他汙染物品應棄去。實驗完畢用消毒水浸泡的紗布擦臺面。

　　4、防止細胞交叉汙染

　　在進行多種細胞培養操作時，所用器具要嚴格區分。

　　在進行換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及細胞培養瓶瓶口，以免把細胞帶到培養液中汙染其他細胞。

　　細胞一旦購置或從別處引入，均應及早留種凍存，一旦發生汙染可重新復甦培養。

　　5、無菌室的徹底消毒

　　1) 0.1%新潔爾滅全面徹底擦洗無菌室;

　　2)甲醛燻蒸法：甲醛是一種廣譜滅菌劑菌，其水溶液和氣休對各種細菌、芽孢及真菌等微生物均有殺滅作用。