cDNA末端快速擴增技術(rapid amplification of cDNA ends, RACE)是基於PCR技術由已知的部分cDNA序列來獲得完整的cDNA全長序列的一種實驗方法，該技術由Frohman等人在1988年首次提出。該技術提出以來經過不斷改進，克服了早期技術步驟多、時間長、特異性差的缺點，2013年Freeman提出了SMART (「Switching Mechanism At RNA Termini」) RACE技術，現在成為SMARTer RACE，該技術獲得的5』端序列更加充實。目前使用的RACE方法均為SMARTer RACE。
圖(a) 5』RACE SMARTer cDNA第一鏈的合成
圖(b) 5』RACE和3』RACE反應中基因特異性引物
圖(c) 使用SMARTer RACE克隆全長cDNA的步驟流程示意圖
（SMART™ RACE cDNA Amplification Kit）：
RACE cDNA第一鏈的合成
1、在PCR管中冰上配製下面的反應體系，混勻瞬時離心，室溫放置到第7步。
2 μL 5×First-Strand Buffer
1 μL DTT (20mM)
1 μL dNTP Mix (10mM)
2、在新的管子裡配製下列物質：
5』RACE: 1-2.75 μL RNA 3』RACE: 1-3.75 μL RNA
1 μL 5』-CDs Primer A 1 μL 3』-CDs Primer A
3、在第2步中加入ddH2O，使5』 RACE體積到3.75 μL，3』RACE體積到4.75 μL。
4、混勻並瞬時離心。
5、在PCR儀上進行如下程序：72°C，3 min；42°C，2 min。
反應結束後瞬時離心。
6、在5』RACE裡加入1 μL SMARTer IIA oligo。
7、配製如下反應體系：
4 μL Bufifier Mix from Step 1
0.25 μL Rnase Inhibitor (40U/μL)
1μL SMARTScribeTM Reverse Transcriptase (100U)
8、配製如下反應體系：
5』RACE: 3』RACE:
5.25 μL Master Mix from Step 7 5.25 μL Master Mix from Step 7
4.75 μL 5』RACE cDNA from Step 6 4.75 μL 3』RACE cDNA from Step 6
9、輕輕吹打混勻，瞬時離心。
10、在PCR儀上進行如下反應：42°C，90 min；70°C，10 min。
11、使用Tricine-EDTA Buffer稀釋反應產物：
如果初始總RNA≤200 ng，加20μL Buffer稀釋；
如果初始總RNA≥200 ng，加100μL Buffer稀釋；
如果初始是Poly A+ RNA，加250μL Buffer稀釋。
稀釋後樣品用於後續PCR克隆或放置-20°C保存（保質期3個月）
RACE PCR反應（使用Takara LA taq酶）
1、根據已知序列設計RACE引物，通常每端設計兩到三輪引物，每輪引物之間間隔20-100bp鹼基，第一輪引物Tm至在65°C以上，以後每輪引物Tm值升高2°C。為方便測序結果比對，第三輪引物離已知序列的末端應間隔20bp以上。
2、RACE第一輪PCR
PCR管中配製反應體系如下：
0.5μL LA taq （5U/μL）
5 μL 10×LA Buffer
8 μL dNTP Mix
1 μL cDNA 模板
1μL UPM Primer
1μL第一輪引物
33.5μL ddH2O
在PCR儀上進行如下反應：94°C，1 min→98°C，10 s；65°C，15 s；72°C，2 min；30個循環→72°C，10 min。
3、RACE第二輪PCR
PCR管中配製反應體系如下：
0.5μL LA taq （5U/μL）
5 μL 10×LA Buffer
8 μL dNTP Mix
1 μL 第一輪PCR產物稀釋50倍
1μL NUP Primer
1μL第二輪引物
33.5μL ddH2O
在PCR儀上進行如下反應：94°C，1 min→98°C，10 s；67°C，15 s；72°C，2 min；30個循環→72°C，10 min。
4、RACE第三輪PCR
PCR管中配製反應體系如下：
0.5μL LA taq （5U/μL）
5 μL 10×LA Buffer
8 μL dNTP Mix
1 μL 第二輪PCR產物稀釋50倍
1μL NUP Primer
1μL第三輪引物
33.5μL ddH2O
在PCR儀上進行如下反應：94°C，1 min→98°C，10 s；69°C，15 s；72°C，2 min；30個循環→72°C，10 min。
5、將第三輪PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳跑膠確認條帶。
6、將獲得的目的條帶送去測序。
7、測序結果與已知的部分序列進行比對，獲得兩端未知的序列，拼接得到全長序列。
cDNA全長克隆
根據RACE獲得的全長序列設計全長引物，進行PCR克隆，獲得基因全長。
圖基因全長克隆結果
參考文獻：Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5' and 3' RACE. DOI: 10.1007/978-1-60327-369-5_1
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