首先我們再回憶一下，細胞劃痕後遷移的過程，如下圖：
細胞遷移動態圖（來自網絡）
從上圖看到，當人為地劃開一個空白無細胞地帶即「傷口」後，劃痕邊緣的細胞便會努力移動並逐漸覆蓋空白區域來使傷口癒合。然而遷移的形狀不會再像我們當時劃的線那麼「規規矩矩」，而是「張牙舞爪」的，進而形成各異的形狀。因此，在劃痕實驗中，統計二維的面積是目前最合適也是最常用的方法。
對於面積的統計，最好用的軟體即ImageJ，它和GraphPad可堪稱是科研界中的兩大神器。下面就看看ImageJ如何實現的吧！
ImageJ的簡介
ImageJ是一個基於java的公共的圖像處理軟體，它是由National Institutes of Health（NIH）開發的一款功能強大的免費軟體，在生物及醫學圖像分析中起著非常重要的作用，除了進行細胞劃痕實驗分析，還可進行細胞計數，DNA電泳條帶和Western blot條帶灰度值分析，螢光圖片共定位分析等，受到高大上的期刊雜誌普遍承認。
ImageJ界面圖
今天就給大家介紹一下如何用ImageJ計算細胞的劃痕面積
1. 導入拍照圖片
File→open:打開要測量的劃痕圖(以剛劃線的人肺癌細胞A549為例)
2. 轉換圖片格式 Image→Type→8-bit(調成灰度圖片，此步驟非常重要，必須轉換)
Tips:ImageJ軟體的數據類型有：8位灰度或索引色，16位無符號整數，32位浮點和RGB色彩。由於許多操作是在灰色圖像上完成的，因此將圖片進行轉換是十分必要的，此處將圖片轉換成8-bit的目的是：將圖片調成灰色，加強圖像的對比度。
3. 增強對比Process→Enhance Contrast
出現以下界面：
在Saturated pixels中輸入0.3%，勾選Normalize，點擊OK，效果如下圖：
4. 加強平滑效果 Process→Enhance Smooth
5. 找到劃痕邊緣 Process→FindEdges
6. 調整閾值 Image→Adjust→Threshold
調整閾值目的：將圖片轉換成灰度圖之後，通過設置閾值，使高於閾值的部分凸顯出來，方便軟體識別並計算其目的區域大小，或方便計數；
綠框：設置Default為Red，即默認值為紅；
紅框：適當調節綠框中的值使細胞的亮度更明顯（也可以使用默認值，調節閾值的範圍為0-20），本例中調節的閾值為20.
隨後點擊Apply，效果如下：
7. 選擇目的區域
選擇魔棒工具，點擊黑色的劃痕部分（即細胞劃痕區域），如下圖：
黃色包圍的面積即為測量的劃痕區
8. 實驗結果出爐Analyze→Measure
Tips: 紅色框內的數值即為測得的劃痕區面積值（面積值的單位是平方像素pixel2）
為了計算細胞遷移率，可選擇適當的時間點如6，12，24h後細胞圖片，再進行上述操作。如下圖為人肺癌細胞A549在0h和24h的遷移圖片，遷移率(或傷口癒合的百分比)即：24h遷移面積（0h的劃痕面積-24h的劃痕面積）與0h面積的比值。
人肺癌細胞A549遷移及劃痕面積統計圖
我們在使用該軟體時常會遇到哪些問題呢？
1. 關於ImageJ軟體下載？
首先，可以進入ImageJ官網：https://imagej.nih.gov/ij/進行下載；其次，ImageJ可運行於Microsoft Windows，MacOS X,Linux和Sharp Zaurus PDA等多種平臺，不同的平臺所下載的ImageJ安裝包不同，可根據需求，下載相應的ImageJ安裝包。
2. 在用ImageJ處理劃痕面積時出現圖片全黑的情況？
首先，確認圖片清晰，光線均勻，細胞區域和劃痕區域有明顯的界限；其次，可以改變圖片的處理方式，可將劃痕區域處理成紅色，然後用魔棒工具選取劃痕區域，這樣可以避免出現由於劃痕不明顯造成用ImageJ處理過程中出現圖片全黑的現象。具體操作請見上文步驟6。
3. 那關於面積單位？
如果不進行標尺校正，得到的長度單位為pixel像素，面積單位為平方像素pixel2。
4. 如何利用ImageJ在圖片中加上標尺校對呢？
打開ImageJ軟體和圖片，點擊Analyze——Tools —— Scale Bar，然後輸入想要顯示的長度即可。
5. 對用於ImageJ軟體分析的圖片的要求？
ImageJ軟體固然好用，其對圖片本身的要求也較高，光線要均勻，在拍攝圖片的過程中，應選擇合適的放大倍數和視野大小。
6. ImageJ除了用統計面積外，還可以用什麼方法？
還可使用Image J 軟體，劃取6至8條水平線，計算細胞間距離的均值，並計算出遷移速度。但是統計面積的方法更加直觀，可靠。
以上就是利用ImageJ進行劃痕面積的統計步驟，看似步驟複雜，其實跟著步驟做，是一項很容易get到的技能哦！除了進行細胞劃痕實驗分析，ImageJ還可進行細胞計數，DNA電泳條帶和WB條帶灰度值分析，螢光圖片共定位分析等，功能十分強大，是名副其實的神器。後期我們都會詳細介紹！如果你需要軟體安裝包或想獲取軟體更多信息，可以關注我們公眾號或者加入下方群聊，即可獲取哦！
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