大腸桿菌雜交及基因定位實驗

一、原理

大腸桿菌染色體呈環狀。高頻重組菌株（Hfr）的染色體上整合有F因子，當Hfr細菌與F^－細菌細胞發生接合（即雜交）時Hfr細胞（供體菌）的染色體從Hfr細胞向F^－細胞內轉移。由於染色體的轉移具有一定的方向性，並且可以隨時中斷，因此根據結合後F^－細菌（以重組子形式選出）中Hfr細菌染色體基因出現次數的多少，即可得知基因轉移的先後順序，也就是說基因在染色體上排列的順序。轉移時，靠近轉移起始點的染色體基因進入F^－細胞的機率大，重組頻率高，遠離轉移起始點的基因進入F^－細胞的機會少，重組率低，F因子大部分位於轉移起始點相對的一端（末端）。因此轉移的頻率很低。只有當接合時間很長，足以使整個染色體轉入F^－細胞（受體）時，才會使F^－細胞轉變為Hfr或F^＋狀態。

基因定位時首先要從Hfr與F^－細菌的混合培養物中篩選出某一Hfr與F^－細菌基因（選擇性標記基因）已經發生了重組的細菌（重組子），然後在這些重組子中逐個測定其它的Hfr基因（非選擇標記）出現的次數。Hfr菌株染色體上的選擇性標記應位於染色體前端，這樣才能保證以100％的頻率出現在重組子中。選擇性標記之後的基因，則以低於100％的頻率出現在重組子中。F^－細胞的選擇性標記應起到排除Hfr菌生長的作用（即反選擇）。本實驗使用的F^－菌株為Str^r, Hfr菌為Str^s,藉此可排除Hfr菌的生長。另一方面為保證Hfr基因有機會出現在重組子中，反選擇性標記應位於染色體後端。為了使Hfr菌株有較高的接合頻率，F^－細菌應該過量以保證每一個Hfr細菌都能與F^－細菌接合（10～20：1）。

二、目的

通過本實驗，了解大腸桿菌雜交及其基因在染色體上的排列方式，並掌握大腸桿菌接合及染色體基因定位的原理與方法。

三、材料、試劑與器具

1、受體菌：FD1004　F^－leu purE trp his metA ilv arg thi ara lacY xyl mtl galT str^r rif^r。
2、供體菌：CSH60 Hfr sup str^s。
3、生理鹽水：0.85%NaCl。
4、10×A緩中液。
5、基本培養基。
6、LB培養基。
7、選擇培養基[B]—[G]：基本培養基加胺基酸（表1－2）。
8、培養皿、三角瓶、吸管、滅菌牙籤、搖床、酒精燈、接種環。

四、操作步驟

1、第一天傍晚，分別接一環供體菌和受體菌於5ml LB培養液中，37℃振蕩培養10－12小時。
2、第二天清晨，各取1ml過夜培養物，分別加入到2個盛有5ml LB培養液的250ml三角瓶，37℃振蕩培養2－3小時。
3、吸取0.5ml供體菌和4.5ml受體菌，加入到一個無菌的250ml三角瓶中混合，置37℃搖床上培養100分鐘。
4、將上述接合菌液用生理鹽水稀釋10⁰、10^-1、10^-2倍。

5、各吸取0.1ml稀釋液塗布在選擇培養基[A]平板上，每一種稀釋液塗布2個平板。同時將供體菌及受體菌分別吸取0.1ml塗布在[A]上作對照，每種各2個平板。此後均於37℃條件下培養48小時。
6、第四天，1）觀察和計數選擇培養基[A]平板上接合組和對照組的菌落生長狀況；2）在與平皿相同大小的白紙上畫100個小格，將圓片貼於選擇培養基[B]、[C]、[D]、[E]、[F]和[G]平板的底部，然後用滅菌牙籤從接合組選擇培養基[A]平板上隨機挑選100個菌落，對號點種在選擇培養基[B]、[C]、[D]、[E]、[F]和[G]平板的100個小格中；3）將所有平板置於37℃箱內培養48小時。
7、第六天，統計在各種選擇平板上生長菌落的數目，記錄。並繪製出基因順序圖。

選擇性培養基附加成份表

培養基 編號	選擇性 標記	基本 碳源	基本培養基（A）中補充物質
			str	rif	arg	ilv	met	leu	ade	trp	his
A	Met leu str	葡萄糖	＋	－	＋	＋	－	－	＋	＋	＋
B	(met leu str)arg	葡萄糖	＋	－	－	＋	－	－	＋	＋	＋
C	(met leu str)trp	葡萄糖	＋	－	＋	＋	－	－	＋	－	＋
D	(met leu str)his	葡萄糖	＋	－	＋	＋	－	－	＋	＋	－
E	(met leu str)lac	乳糖	＋	－	＋	＋	－	－	＋	＋	＋
F	(met leu str)gal	半乳糖	＋	－	＋	＋	－	－	＋	＋	＋
G	(met leu str)rif	葡萄糖	＋	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋