一、 試劑、耗材（略）
二、儀器設備（略）
三、試劑及配製 （略）四、酵母雙雜交文庫構建實驗流程1、 Trizol法RNA的提取RNA電泳圖如下：`2、使用Oligotex mRNA Kits（Qiagen）分離純化樣本的mRNA，mRNA質量可以滿足文庫要求，mRNA總量為6.9 ug，電泳檢測圖片如下3、 酵母雙雜交文庫構建3.1第一鏈cDNA合成3.2 cDNA第二鏈的合成3.3 加5』接頭(3個讀碼框，每個讀碼框連接一份，共3份)3.4 cDNA長度分離， 使用低熔點瓊脂糖電泳cDNA，切膠回收1 Kbp以上的條帶，乙醇沉澱後溶於14 μL水中。3.5 使用Infusion重組反應體系連接cDNA與載體pGADT73.6 電轉化大腸桿菌感受態細胞4、 酵母雙雜交文庫的構建質量鑑定4.1 庫容量的鑑定取轉化後細菌原液10 uL稀釋100倍後，從中取出10 uL塗布LB平板（含氨苄抗性），第二天計數。CFU/mL=平板上的克隆數/10 uL×100倍×1×103 uL文庫總CFU= CFU/mL×文庫菌液總體積（mL）4.2 插入片段大小鑑定從轉化平板上隨機挑取24個單克隆菌落，經PCR擴增後，用電泳檢測PCR產物大小。 結果如下圖所示：
五、 文庫擴增及質粒提取將轉化後原始文庫菌液塗布氨苄抗性培養基平板擴增培養，第二天用液體培養基從平板上洗脫菌苔，取其中2/3體積用Qiagen大抽試劑盒抽提質粒DNA，剩餘1/3體積中加入25%無菌甘油混合均勻後灌裝保種管，凍存於-80℃冰箱。六、文庫菌保存和文庫篩選凍存於-80℃冰箱內，可以保存2年以上，文庫質粒可以直接用於酵母文庫篩選，pGADT7 酵母雙雜交文庫菌的抗性為氨苄抗性（50 ug/mL）
備註：1. 文庫構建使用的引物序列， 雙雜交文庫擴增檢測引物：F：5′-TAATACGACTCACTATAGGGCGAGCGCCGCCATG-3′R：5′-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3′ 如果需要對文庫中的克隆質粒進行測序，請使用以下引物：T7：TAATACGACTCACTATAGGGCADR：GTGAACTTGCGGGGTTTTTC
酵母雙雜交文庫篩選ORF1的相互作用蛋白服務案例
一、試劑、耗材（略）儀器設備（略）試劑及配製 （略）二、誘餌載體構建pGBKT7- ORF1的構建與鑑定（此步驟為常規的實驗方法，可以通過酶切、測序等方法鑑定酵母雜交誘餌載體正確性，此處略）三、ORF1自激活檢測3.1酵母轉化反應將各種質粒轉入受體菌AH109中，觀察檢測結果。
3.2 酵母轉化方法1.從YPDA平板挑取AH109單菌落接種於YPDA液體培養基4 ml，30℃，225 rpm，振蕩培養18-20 h（過夜），至OD600>1.5，一般為4左右。2.轉接YPDA液體培養基，培養體積為50 ml，使初始OD600=0.2，30℃，225 rpm，振蕩培養4-5h，至OD600=0.6。3.離心收菌，室溫，4000 rpm，5 min。4.用20 ml無菌水重懸菌體，混勻，離心收菌，室溫，4000 rpm，5 min，棄上清。5.用5 ml 0.1 M LiAc重懸菌體，混勻，離心收菌，室溫，4000 rpm，5 min，棄上清。6.用500 ul 0.1 M LiAc重懸菌體，混勻，分裝至1.5 ml離心管，每個50 ul（每個轉化），備用。7.每個1.5 ml離心管中依次加入相應試劑，用槍頭吹打混勻，或劇烈振蕩1 min左右，至完全混勻。8. 30℃水浴孵育，30 min。9. 42℃水浴熱激，25 min。10. 30℃水浴復甦，30 min。11.離心收菌，室溫，4000 rpm，5 min，棄上清。12.每個轉化用200 ul無菌水懸浮菌體，儘量溫和地混勻，塗布相應的缺陷型篩選平板。13. 30℃恆溫培養4天。3.3 ORF1自激活檢測結果pGBKT7-ORF1 + pGADT7共轉化AH109長出的酵母轉化子隨機挑取了6個菌落進行自激活檢測。包括HIS3、ADE2和LacZ共3個報告基因的檢測。HIS3和ADE2的檢測採用點板培養的方法，將轉化子點板至SD-TLHA平板，30℃恆溫培養4天，觀察其生長狀態。LacZ報告基因的檢測方法如下：1. 從轉化平板隨機挑取6個菌落於濾紙片上。2. 將濾紙完全浸於液氮中90 s，取出常溫放置2 min晾乾。3. 在培養皿中加入新鮮配製的顯色液，一般9 cm培養皿用2-3 ml顯色液。4. 將顯色液加入培養皿中，再放入一張乾淨的濾紙，讓其完全浸溼，將凍溶後的濾紙放在最上面，使顯色液浸透表層，蓋上皿蓋。30℃避光培養，20 min後開始觀察，一般2 h後可開始看到顏色變化。4-5h拍照記錄結果。
對照菌株在SD-TL缺陷平板上都能正常生長，而僅有陽性對照可在SD-TLHA缺陷平板生長。pGBKT7-ORF1 +pGADT7轉化子中隨機挑選的6個菌落在SD-TLHA缺陷平板上不能生長，生長狀態同陰性對照，LacZ檢測中結果也與陰性對照相同，因此不存在自激活。
自激活檢測結論：ORF1誘餌克隆沒有自激活作用。
四、文庫篩選 用含有正確pGBKT7-ORF1誘餌質粒的AH109酵母轉化子作為受體菌製備感受態，將文庫質粒pGADT7-酵母雙雜-cDNA轉入其中，塗SD-Trp-Leu-His+ 5 mM 3AT平板。
五、影印清除為了消除背景生長菌落的幹擾，在培養到第3天時，用絨布對篩庫平板進行影印清除後，繼續培養7-14天。分批挑取再次長出的轉化子菌落進行下一步檢測。六、陽性克隆鑑定至影印清除後繼續培養7-14天，從篩庫平板中挑取長出的陽性克隆單菌落，共挑取到20個初始陽性克隆轉化子轉接到SD-TL缺陷型平板中繼續培養2-3天。6.1 陽性克隆His和Ade報告基因的檢測將上述SD-TL缺陷型平板上長出的20個初始陽性克隆轉化子分別用無菌水稀釋後點種至SD-TL和SD-TLHA缺陷平板，30℃恆溫培養3-4天，結果如下圖所示：
陽性克隆檢測結果顯示：在20個初始陽性克隆中，有13個能在SD-TLHA生長的是激活了ADE2和HIS3報告基因。
6.2 陽性克隆LacZ報告基因檢測將20個初始陽性克隆用無菌水重懸後點於濾紙片上進行LacZ報告基因檢測。結果如下圖所示：
七、酵母陽性克隆DNA提取和測序比對通過測序比對，可以將重複的陽性給克隆子去除，本實驗案例中，有多個克隆子為重複的陽性克隆，經過篩除後，我們可以確認獲得了6個完全不同的陽性克隆子。
八、迴轉驗證用含有正確pGBKT7-ORF1誘餌質粒的AH109酵母轉化子作為受體菌製備感受態，將6種陽性克隆質粒DNA分別轉化其中，分別迴轉驗證His和Ade報告基因的檢測和LacZ報告基因檢測。
實驗結論：
本項目以ORF1基因cDNA克隆為誘餌，篩選cDNA酵母雙雜交文庫，在篩選到的20個初始陽性中，經過鑑定結果顯示有13個能激活ADE2、HIS3和LacZ報告基因。經過對這些陽性克隆質粒進行DNA測序和BLAST比對分析，結果表明它們分別屬於6種不同蛋白的編碼基因。 通過對這6種陽性克隆的迴轉驗證檢測，結果顯示所有陽性克隆都能通過對ADE2、HIS3和LacZ報告基因的迴轉驗證。