CRISPR-Cas9文庫技術原理及應用

2020-12-03 漫天飛絮home

CRISPR-Cas9技術原理

CRISPR-Cas9技術憑藉著成本低廉，操作方便，效率高等優點，CRISPR-Cas9技術迅速風靡全球的實驗室，成為了生物科研的有力幫手，是繼「鋅指核酸內切酶（ZFN）」、「類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN）」之後出現的第三代「基因組定點編輯技術」。

CRISPR-Cas9系統最初在大腸桿菌基因組中被發現，是細菌中抵抗外源病毒的免疫系統。CRISPR-Cas9系統由兩部分組成，一部分是用來識別靶基因組的，長度為20bp左右的sgRNA序列，另外一部分是存在於CRISPR位點附近的雙鏈DNA核酸酶——Cas9，能在sgRNA的引導下對靶位點進行切割，最終通過細胞內的非同源性末端連接機制（NHEJ）和同源重組修復機制（HDR）對形成斷裂的DNA進行修復，從而形成基因的敲除和插入，最終實現基因的（定向）編輯。

與前兩代技術相比，CRISPR-Cas9技術最大的突破是不僅可以對單個基因進行編輯，更重要的是可以同時對多個基因進行編輯，這也為全基因組篩選提供了有效的方法。目前比較常見的文庫類型包括：

CRISPR-Cas9 knock out文庫CRISPR panal文庫CRISPRa/i文庫psgRNA文庫

CRISPR-Cas9文庫建庫流程

靶位點確認及sgRNA文庫設計sgRNA文庫晶片合成sgRNA文庫構建QC驗證文庫質量sgRNA文庫慢病毒包裝感染穩定細胞株藥物篩選實驗細胞表型篩選NGS測序驗證功能基因

CRISPR-Cas9文庫應用方向

1、藥物靶點確定與驗證

CRISPR-Cas9篩選技術可以應用於藥物靶點篩選中，通過大規模篩選技術，可以系統的分析、驗證一些與抗藥性相關的基因，從而為疾病治療提供相關數據。SCIENCE發表文章[1]，研究人員利用CRISPR-Cas9文庫篩選人類黑色素瘤A375細胞中的18,080個基因進行篩選，最終發現NF2、CUL3等4個基因參與了黑色素瘤A375細胞中的耐藥調節過程。

2、基因環路上下遊調控機制分析

CRISPR-Cas9文庫篩選技術不僅可以用於編輯人類細胞蛋白編碼基因，對於基因組中的調控元件也同樣有效，利用這種方法可以對基因環路上遊有調控機制進行分析。Nature biotechnology發表文章[2]，科研人員利用CRISPR-Cas9文庫對癌症細胞中關鍵的轉錄因子p53和ERα的增強子元件的685個基因位點進行篩查。通過CRISPR-Cas9文庫篩選，共鑑定出3個增強元件與ERα的相關；3個增強元件與p53功能相關聯的3個增強子，其中2個增強元件與p53完全結合才能激活細胞衰老過程。

3、代謝通路調節機制分析

CRISPR-Cas9技術在植物代謝調控中也有相關成果。Plant Biotechnology Journal發表文章[3]，科研人員選擇對番茄植株GABA代謝通路中多個關鍵基因進行基因編輯，GABA作為人體中的抑制性神經遞質，能調節人體免疫、血糖、血壓，具有促進睡眠等功效，對人類健康有重要意義。通過得到六種GABA突變體(包含單基因突變、雙基因突變、三基因突變、四基因突變)，其中四基因突變的GABA-6突變體葉子GABA含量與WT相比提高了19倍，這為CRISPR-Cas9多靶點敲除技術在植株代謝調控中的應用研究提供了參考。

4、Long noncoding RNA作用機制分析

CRISPR-Cas9文庫的建立可以實現基因組的大規模篩選，為了對非編碼基因的功能進行驗證，Nature biotechnology發表文章[4]，提出構建了psgRNAs文庫的方法，這種成對的sgRNA可在同一基因中造成兩處斷裂，形成大片段缺失，從而影響表型變化，成為研究非編碼基因的重要方法。使用慢病毒psgRNA文庫，對人源肝癌細胞系Huh7.5OC進行基因組的700個lncRNA和另外5種癌症細胞進行敲除實驗，最終篩選到51個lncRNA基因能夠促進或者抑制腫瘤的生長。

參考文獻

1. Shalem, O., et al., Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science, 2014. 343(6166): p. 84-7

2. Korkmaz, G., et al., Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol, 2016. 34(2): p. 192-8.

3. Li, R., et al., Multiplexed CRISPR/Cas9-mediated metabolic engineering of gamma-aminobutyric acid levels in Solanum lycopersicum. Plant Biotechnol J, 2017

4. Zhu, S., et al., Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nat Biotechnol, 2016.34(12): p. 1279-1286.

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  • CRISPR/Cas9技術原理簡介
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