CRISPR/Cas9技術是近幾年來被廣泛應用的基因編輯技術，其利用了細胞自身的非同源末端修復機制(nonhomologousend joining,NHEJ)，當DNA被打斷後能夠在其斷裂位置隨機地引入突變，從而達到對DNA特定位點進行修飾的目的。相較於以往的鋅指核酸酶技術（zinc finger nucleases,ZFNs）和轉錄激活樣效應子核酸酶技術（transcription-activator-like effectornucleases,TALENs），CRISPR/Cas9更加簡單、高效。 ZFNs和TALENs靶點的組裝過程複雜、用時長、實驗成本高且失敗率較高，CRISPR/Cas9與之相比則大大簡化了操作步驟，提高了突變效率縮短了檢測和驗證的時間，減少了實驗成本，因而得到了許多科學家的青睞。
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✚ CRISPR系統
CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat）——規律間隔成簇短回文重複序列，是一種在細菌和古細菌中發現的用於抵抗外界病毒或噬菌體等外源DNA入侵的自我防禦系統，與真菌中RNAi的途徑相似。一個有效的CRISPR系統包含兩部分：一部分是基因組(染色體或質粒)中的CRISPR陣列，由一系列高度保守的重複序列(repeat)和外源DNA的間隔序列(spacer)相間排列而成；第二部分是位於CRISPR陣列附近的成簇Cas基因，Cas基因包括一些核酸酶、解旋酶、聚合酶和RNA結合蛋白等，參與CRISPR介導的免疫過程的各步驟。CRISPR系統可利用小RNA和CRISPR相關的Cas蛋白靶向外源的DNA並將其進行切割，以起到自我保護的作用。根據CRISPR RNA、核酸酶以及識別位點的不同，目前已經在細菌和古細菌中鑑定出三種類型的CRISPR系統（I-III），每個系統都包含有一組CRISPR相關基因（Cas）、非編碼RNA和特異性重複元件，這些重複元件來自於外源的DNA的間隔序列，他們共同組成了CRISPR RNA（crRNA）陣列。
CRISPR系統發揮作用的主要流程為：外來DNA片段的採集—CRISPR RNA的生物合成—靶向DNA序列的幹擾。
首先進行外來DNA的採集，Cas蛋白能夠識別外源的核酸，入侵DNA的短片段（protospacers,30-50bp）會插入到宿主CRISPR位點的中，被重複序列間隔開，形成間隔序列—重複序列單元。在I型和II型CRISPR系統中，外源DNA的間隔序列前體(protospacer)側翼有一段保守短序列（2-5nt），即間隔序列前體旁基序(protospacer adjacent motif,PAM)，PAM會被識別並在此獲得外源DNA的間隔序列前體。外源DNA的間隔序列前體的整合伴隨著重複序列的複製，這可能與宿主內的聚合酶以及DNA修復機制相關。
CRISPR RNA的生物合成，CRISPR 陣列在前導序列（leader sequence）的驅動下轉錄出一條前體CRISPR RNA（prepare CRISPR RNA,pre-crRNA），隨後pre-crRNA會被核酸內切酶加工成短的CRISPR RNA（crRNA），每條crRNA上都有間隔序列-重複序列單元。
成熟的CRISPR RNA會與入侵的DNA或RNA進行鹼基互補，並引導Cas蛋白至互補的靶序列上，Cas蛋白就會發揮作用，降解靶序列。I型和III型CRISPR系統都依賴於多亞基複合物來探測靶序列，II型CRISPR系統則是依靠單一的Cas9和兩個RNA複合物來完成靶序列的降解，I型和II型CRISPR系統都會識別帶有PAM區域的DNA片段，而III型CRISPR系統不依賴與PAM區域的識別。
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✚ CRISPR/Cas9基因編輯系統
目前CRISPR系統中研究最多、應用最廣泛的一種是從化膿性鏈球菌中得到的II型CRISPR系統，II型CRISPR系統僅由Cas9核酸內切酶和兩種小RNA：crRNA和tracrRNA構成。此系統中，CRISPR基因在轉錄出一條pre-crRNA後，會反式激活CRISPR RNA(trans-activating CRISPR RNA, tracrRNA)與pre-crRNA的重複序列進行鹼基互補配對，隨後在RNaseIII等酶的作用下，形成成熟的crRNA-tracrRNA結構。crRNA-tracrRNA與Cas9核酸酶進一步形成複合體，並引導Cas9蛋白到靶向DNA序列，Cas9蛋白發揮作用切割與間隔序列匹配的靶向DNA。PAM區位於DNA間隔序列前體的3』端，Cas9在靶向DNA序列PAM區上遊的3nt位置進行雙鏈切割。
成熟的crRNA-tracrRNA複合體能引導Cas9在靶DNA處產生DSB，研究人員發現，將這兩個RNA分子融合成一個約100 nt的單鏈嚮導RNA(guide RNA，gRNA)，也能有效的引導Cas9蛋白到靶點位置執行切割DNA的功能，從而在特定的位置引入突變。gRNA的有效性在細菌、酵母、斑馬魚、小鼠、擬南芥和水稻等生物中都得到了證實。CRISPR/Cas9在生物體中引入突變的效率遠遠高於ZFNs和TALENs等基因編輯技術。利用CRISPR/Cas9系統，只需在體外依據靶點合成gRNA和Cas9 mRNA共注射到特定細胞中，就可以構建對靶向DNA進行修飾的突變體（圖1）。
圖1. CRISPR-Cas9原理圖（圖片來自網絡）
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✚ CRISPR/Cas9基因編輯系統的操作流程
1.根據基因的序列特點確定靶點的位置，進行靶點的選擇。
2.構建CRISPR/Cas9 sgRNA質粒表達載體。
3.合成靶點並檢測靶點的靶向和切割效率。
4.篩選能夠穩定遺傳的突變體並確認突變類型。
5.通過雜交等技術來獲得能夠穩定遺傳的雜合突變體和純合突變體。
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✚ CRISPR/Cas9基因編輯系統的應用
CRISPR/Cas9作為一種新興的基因編輯技術，相較於以往傳統的基因編輯技術有著更加明顯的優勢，CIRPSR/Cas9靶點的設計與合成更加簡單、快速，基因編輯的效率更高，成本更低，有著更加廣闊的應用前景。
＋在基礎研究中的應用
﹢﹢功能基因的篩選
因CRISPR/Cas9技術使基因敲除的過程更加簡單，只要改變gRNA的序列就能靶向不同的位點，所以在研究基因功能的過程中，可以利用CRISPR/Cas9技術進行大規模的基因編輯，能夠快速高效地構建基因敲除或敲入突變體，進行功能基因的篩選。除此之外還能夠對DNA上的非編碼區域進行編輯，發現基因的調控因子、啟動子或其他相關結構區域，為更加方便快捷地研究基因的結構和功能提供了有力保障。
﹢﹢轉錄調控
除了利用CRISPR/Cas9進行基因功能的研究和篩選，還可以利用CRISPR/Cas9技術進行轉錄的調控，將Cas9靶向基因的調控區域，可以在不改變基因序列的情況下條件性的激活或抑制目的基因的表達。除此之外，還可以靶向基因的修飾位點，來研究基因在特定位點的修飾對於基因功能的特殊影響。
＋在疾病研究中的應用
﹢﹢構建疾病模型
利用CRISPR/Cas9技術，可以在一些模式生物中（果蠅、斑馬魚、小鼠等）根據已有的研究結果，構建特定基因敲除或敲入突變體，構建模式生物疾病模型，這種疾病模型可用於疾病病理的研究和藥物的篩選。
利用CRISPR-Cas9系統構建較高的誘變率的斑馬魚突變體，利用密碼子優化的Cas9和雙NLS標籤能更好表達和核定位。 系統中的Cas9蛋白序列與體外使用的Cas9蛋白序列和最近報導的哺乳動物和斑馬魚研究略有不同。 實驗結果還表明，並非所有基因組位點都可以通過CRISPR / Cas9系統進行誘變。研究靶向Tg（-5.1mnx1：EGFP），tyr和ddx19基因座始終導致比靶向gol和mitfa更高的誘變率。測試這些靶標的一系列gRNA / Cas9濃度不會改變這種趨勢，表明靶位點的內在特性（例如，染色質/表觀遺傳狀態，轉錄活性等）和/或靶向gRNA（例如，RNA二級結構，對Cas9的親和力等）可能影響靶向效率。除了斑馬魚模型，這種RNA指導的基因組編輯策略具有在其他模式生物中廣泛應用的潛力（圖2）。
圖2. CRISPR-Cas9技術構建疾病模型（PNAS,2013）
﹢﹢疾病的治療
對於一些遺傳性的疾病，也可以利用CRISPR/Cas9技術對基因進行改造，對引起遺傳病的基因進行特定位點的突變，從而達到治療疾病的目的。也有研究表明，利用CRISPR/Cas9基因編輯系統可以清除體內的病毒，抑制病毒在體內的複製和表達，治療病毒引起的疾病。在治療腫瘤方面，CRISPR/Cas9可在特定的組織通過誘導發揮作用，敲除體內某些癌症相關基因，從而達到治療或者預防癌症的目的。
為了鑑定急性髓性白血病（AML）治療的新靶點，使用表現出正常核型且具有功能正常的Trp53的AML細胞系進行全基因組CRISPR-Cas9篩選。 然後使用與化學抑制劑和人類遺傳學相關的資料庫選擇了可行的可操作目標。將DCPS確定為AML治療的藥物靶標。 RG3039是一種在一期臨床試驗中被證明是安全的DCPS抑制劑，具有抗白血病活性，並可鑑定AML存活所需的前mRNA代謝途徑。 研究結果揭示了前mRNA代謝途徑，並發現DCPS可以作為AML的潛在治療靶點（圖3）。
圖3. 通過CRISPR-Cas9篩選得到AML治療靶點 （Cancer cell,2018）
＋在遺傳與育種方面的應用
基因CRISPR/Cas9基因編輯系統的特性，能夠應用於動植物的遺傳與育種方面，可以對一些疾病基因進行編輯起到抗病蟲害的作用，對控制產量相關的基因進行定向改造，增產增收，也有研究發現，CRISPR/Cas9技術對於清楚植物體內的病毒，也有一定的作用。目前相關利用CRISPR/Cas9基因編輯系統進行動植物的遺傳與育種的研究也在廣泛開展。
隨著對於CRISPR-Cas9基因編輯系統的研究越來越深入，其應用的範圍也越來越廣泛，因其操作簡便，成本低且效率高，得到了科學家們的青睞，現在CRISPR-Cas9在科研方面，疾病的治療以及育種方面都有著廣泛的應用，在以後的研究中，CRISPR-Cas9的應用範圍還將更加廣泛。