關於酵母雙雜交系統,你一定需要知道這些!!

試劑君當年考研的時候，被《細胞生物學》的一道大題折磨瘋，它問 ——「研究蛋白質互作，你腦子會想到什麼？」我我..我能想到什麼，我只能想到絕望啊~

當時模模糊糊地就寫了一個『酵母雙雜交』，事情已過多年，試劑君的印象還是很深（可見被考研殘害了多久）。雖然之後，我的研究並沒有用到這一門技術，但是卻對它印象很深，還特地去查過一些資料，現在就寫在這裡放送給大家啦。

酵母雙雜交

酵母雙雜交由Fields在1989年提出，主要用於在酵母體內分析蛋白質-蛋白質相互作用的基因系統，也是轉錄因子模塊結構的一種遺傳學方法。

酵母雙雜交系統是在真核模式生物酵母下進行的，研究活細胞內的蛋白質相互作用，對蛋白質之間微弱的、瞬間的作用也能通過報告基因的表達產物敏感的觀察到。

該技術既可以用來研究哺乳動物基因組編碼的蛋白質之間的作用，又可以用來研究植物基因組編碼的蛋白質之間的作用。

酵母雙雜交系統可以檢測蛋白質之間的相互作用，而且更重要的在於發現新的與已知蛋白相互作用的未知蛋白。

實驗原理

在雙雜交系統中，BD與X蛋白融合，AD與Y蛋白融合，如果X、Y之間形成蛋白-蛋白複合物，使GAL4兩個結構域重新構成，則會啟動特異基因序列的轉錄。

一般地，將BD-X的融合蛋白稱作誘餌(bait)，X往往是已知蛋白，AD-Y稱作獵物(prey)，能顯示誘餌和獵物相互作用的基因稱報告基因，通過對報告基因的檢測，反過來可判斷誘餌和獵物之間是否存在相互作用。

因此，酵母雙雜交可以簡要概括為：基因轉錄所需的轉錄因子的兩個結構域在兩個互作蛋白的吸引下位置靠近，誘導了基因的表達。

篩選流程

當我們將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到AD-LIBRARY質粒，對質粒中的cDNA片段進行測序，並對該片段的編碼序列在GENEBANK中進行比較，研究與已知基因在生物學功能上的聯繫。

雙雜交系統的另一個重要的元件是報導株。

報導株指經改造的、含報導基因(reporter gene)的重組質粒的宿主細胞。最常用的是酵母細胞， 酵母細胞作為報導株的酵母雙雜交系統具有許多優點：

易於轉化、便於回收擴增質粒。

具有可直接進行選擇的標記基因和特徵性報導基因。

酵母的內源性蛋白不易同來源於哺乳動物的蛋白結合。

如何優雅的選擇酵母雙雜體系？

市場上常見的酵母雙雜體系是核體系和膜體系雜交文庫，核體系酵母雙雜交文庫包括Clontech體系和Invitrogen體系，膜體系是Dual systerm體系。

注意：水稻等高GC物種最好選擇Invitrogen體系而不是Clontech體系。Clontech體系過程中需要進行PCR過程，而Invitrogen體系則是直接由mRNA 反轉錄即可。高GC會影響二鏈PCR的擴增效率，所以一般高GC物種在建庫的時候都會選擇Invitrogen體系，但Invitrogen體系需要的樣本量較高。

酵母雙雜的常見問題

1. 假陽性高

所謂假陽性就是：在待研究的兩個蛋白間沒有發生相互作用的情況下，報告基因被激活。為排除假陽性就需要作嚴格的對照試驗。應對誘餌和靶蛋白分別作單獨激活報告基因的鑑定。

目前很多技術服務公司推出的酵母雙雜系統都採用了多個報告基因，且每個報告基因的上遊調控區各不相同，這可減少大量的假陽性。

2. 轉化率低

轉化效率是酵母雙雜交文庫篩選時成敗的關鍵之一，特別是對低豐度cDNA庫進行篩選時，必須提高轉化效率。轉化時可採用共轉化或依次轉化，相比之下共轉化省時省力。更重要的是如果單獨轉化會發生融合表達蛋白對酵母細胞的毒性時，共轉化則可以減弱或消除這種毒性。

一種更有效的方法是：將誘餌蛋白載體與靶蛋白載體分別轉入不同接合型的單倍體酵母中，通過兩種接合型單倍體細胞的雜交將誘餌蛋白與靶蛋白帶入同一個二倍體細胞。

講了這麼多，你心裡對酵母雙雜交是不是有些概念了呢？如果沒有，那就再看一遍吧~

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