酵母雙雜交實驗常見疑難解答

2020-11-22 生物谷
問：如果誘餌蛋白對酵母細胞是有毒的，該怎麼辦？

答：在有些情況下，在液體培養基中培養不好的菌珠可以在固體培養基上生長得很好。重懸克隆於1ml的SD/–Trp，接著將重懸液平鋪於5 個100-mm的SD/–Trp平板。在30℃下溫浴，直至平板上的克隆互相粘在一起。用5ml 0.5X YPDA刮下每塊板上的克隆，並收集到一管中。接著就使用這個細胞重懸液進行正常的雜交反應。

問：我的誘餌蛋白能直接激活報告基因的表達，該如何處理？

答：該蛋白很可能有轉錄激活域，是個轉錄因子。這可以通過基因重組切掉轉錄激活域，然後重新檢測其是否自激活。但重組也有可能破壞蛋白之間的互作。

問：轉化效率太低，怎麼辦？
答：1. 檢測一下DNA的純度，如果可以的話，重新用乙醇純化。
2. DNA-BD/誘餌蛋白很可能是有毒的。
3. 不適當的培養基，重新配製培養基，並做對照轉化。
4. 檢測pGBT9對照載體的轉化效率，放置於SD/–Trp平板上，轉化效率應該在1 x 105 colonies/mg DNA以上。

問：雜交效率不高，該如何處理？
答：在雜交中，預轉化的誘餌細胞的數量可能不夠。當你對誘餌菌株進行液體培養過夜時，應挑選大的，新鮮的克隆進行培養。經過離心和重懸後，使用血球計對細胞進行計數。密度應該在1 x 109/ml。
    一個甚至兩個融合蛋白對酵母細胞有毒。你可以通過重組方法來減輕毒性，同時又能保證蛋白的相互作用。或者使用表達水平較低的載體。也可以在瓊脂平板或濾膜上進行雜交。但同時必須作雜交對照實驗。

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