知無不「研」|一文讀懂酵母單/雙雜交點對點驗證

2021-01-11 蛋白質組學技術交流

一、前言

酵母雙雜交由Fields和Song在1989年提出. 他的產生是基於對真核細胞轉錄因子特別是酵母轉錄因子GAL4性質的研究。酵母雙雜交就是基因轉錄所需的轉錄因子的兩個結構域在兩個互作蛋白的吸引下位置靠近，誘導了基因的表達。酵母雙雜交系統的最主要的應用是快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用，及分離新的與已知蛋白作用的配體及其編碼基因。酵母雙雜交系統檢測蛋白之間的相互作用具有以下優點：

⑴ 作用信號是在融合基因表達後， 在細胞內重建轉錄因子的作用而給出的， 省去了純化蛋白質的繁瑣步驟。⑵ 檢測在活細胞內進行， 可以在一定程度上代表細胞內的真實情況。⑶ 檢測的結果可以是基因表達產物的積累效應， 因而可檢測存在於蛋白質之間的微弱的或暫時的相互作用。⑷ 酵母雙雜交系統可採用不同組織、器官、細胞類型和分化時期材料構建cDNA文庫， 能分析細胞漿、細胞核及膜結合蛋白等多種不同亞細胞部位及功能的蛋白。二、酵母單/雙雜交簡介1、酵母單雜交 酵母單雜交技術是在酵母雙雜基礎上發展而來的一種研究核酸-蛋白相互作用的工具，被廣泛用於研究真核細胞內基因的表達調控，如鑑別DNA結合位點發現潛在的結合蛋白基因、分析DNA結合結構域信息等。

2、酵母雙雜交酵母雙雜交及系統是一種鑑定和檢測蛋白質相互作用的研究方法，因其具有靈敏性高、功能強大、適用範圍廣等特點，現已被應用於多個研究領域。①核蛋白酵母雙雜交： 核蛋白酵母雙雜交技術最初由Fields等人在研究酵母轉錄因子GAL4性質時建立，後續經過不斷改進已發展成為一種成熟的蛋白-蛋白互作研究工具，具有簡便、靈敏、可反映蛋白在活細胞內互作真實情況的特點，被廣泛應用於互作蛋白的篩選、蛋白相互作用的鑑定/驗證、蛋白互作機理的探究、蛋白連鎖圖譜繪製等工作。

②膜蛋白酵母雙雜交：DUALmembrane技術在傳統的酵母雙雜交系統的基礎上，巧妙地利用分離的泛素系統（split-ubiquitin）進行蛋白質相互作用的篩選；泛素作為降解信號分子，人為分成兩部分：N端（Nub），C端（Cub），互補重構的完整泛素分子可被泛素專一性蛋白酶（UBPs）識別，從而導致與泛素相連的蛋白被酶解。

三、核酵母單/雙雜交點對點驗證流程簡介及圖片分析A為誘餌，B為獵物。篩選涉及到的報告基因：（1）HIS3。（2）ADE2。（3）MEL1。誘餌質粒PGBKT7攜帶trp基因, ， 獵物質粒PGADT7攜帶Leu基因。篩選涉及到的平板：DDO[SD/-Leu/-Trp]，DDO/X[SD/-Leu/-Trp/X-α-gal]，TDO /X [SD/-Leu/-Trp/HIS3/X-α-gal]，QDO /X[SD/-Leu/-Trp/HIS3/Ade2/X-α-gal]1、誘餌自激活驗證

分析：誘餌質粒重組質粒PGBKT7-A和獵物空載PGADT7共轉化Y2Hgold酵母菌株。（1）塗布DDO平板能夠生長，說明誘餌PGBKT7-A+ PGADT7已成功轉入宿主菌中且對宿主菌無毒性；（2）塗布TDO平板，不能生長，說明誘餌PGBKT7-A+ PGADT7無自激活現象，不能激活宿主菌報告基因his的表達；（3）塗布QDO平板沒長，說明誘餌PGBKT7-A+ PGADT7無自激活現象，沒有激活報告基因ADE2。2、共轉驗證——陰陽性對照

3、共轉驗證——實驗組

分析：誘餌重組質粒PGBKT7-A和獵物重組PGADT7-B共轉化Y2Hgold酵母菌株。（1）塗布DDO平板能夠生長，說明誘餌PGBKT7-A+ PGADT7-B已成功轉入宿主菌中且對宿主菌無毒性；（2）塗布TDO平板能生長，說明誘餌PGBKT7-A+ PGADT7-B能夠互作，激活了宿主菌報告基因HIS3的表達；（3）塗布QDO平板能長，說明誘餌PGBKT7-A+ PGADT7-B能夠互作，同時激活了報告基因HIS3和ADE2的表達。4、雙雜點種圖

1自激活: Y2H[PGBKT7-A+ PGADT7]2實驗組: Y2H[PGBKT7-A+ PGADT7-B]3陽性對照: Y2H[pGBKT7-53+pGADT7-T]4陰性對照: Y2H[pGBKT7-lam+pGADT7-T]5、酵母單雜點對點驗證示意圖P為誘餌啟動子，B為獵物。單雜篩選報告和抗性基因：AbAr/ AUR-C，AUR1基因的一個顯性突變版本，編碼肌醇磷酸化神經醯胺syn- thase酶。AUR1-C在Y2HGold/ Y1HGold酵母株中表達，是由於蛋白質與蛋白質的相互作用，使GAL4轉錄激活和DNA結合域接近。可以添加ABA進行背景抑制。,誘餌質粒PABAI攜帶Ura基因，獵物質粒PGADT7攜帶Leu基因。篩選所用到的平板：SD/- Leu，SD/- Leu/+AbA

自激活結果分析：PGADT7空載轉化含誘餌啟動子PAbAi-PY1Hgold酵母菌株。（1）塗布SD/-Leu平板能夠生長，說明誘餌PAbAi-P已成功轉入宿主菌中且對宿主菌無毒性；（2）塗布SD/-Leu/AbA(100ng/ml)， SD/-Leu/AbA(200ng/ml) 平板能生長，說明200ng/ml的AbA不能抑制報告基因AbAr/ AUR-C ；（3）塗布SD/-Leu/AbA(500ng/ml) ，SD/-Leu/AbA(800ng/ml)，SD/-Leu/AbA(1000ng/ml)平板沒長，說明能夠抑制報告基因AUR1-C的最低AbA濃度為500ng/ml，後續可用AbA(500ng/ml)進行共轉驗證。如果AbA最高抑制濃度1000ng/ml仍然能夠生長，則只能考慮截短誘餌啟動子。6、共轉驗證——陰陽性對照

7、共轉驗證——實驗組

分析：誘餌啟動子重組質粒PAbAi-P轉化Y1Hgold酵母菌株塗布SD/-Ura平板，挑取單克隆菌製備成感受態，將獵物重組質粒PGADT7-B轉化到Y1Hgold【 PAbAi-P 】中。（1）塗布SD/- Leu平板能夠生長，說明獵物重組質粒PGADT7-B已成功轉入宿主菌中且對宿主菌無毒性；（2）塗布SD/- Leu /+AbA (500ng/ml)平板能生長，說明誘餌PAbAi-P + PGADT7-B能夠互作，激活了宿主菌報告基因AbAr/ AUR-C的表達。8、單雜稀釋點種圖

更多參考案例：1、Construction and characterization of a high-quality cDNA library of Cymbidium faberi suitable for yeast one- and twohybrid assays.2、SlAREB1 transcriptional activation of NOR is involved in abscisic acid-modulated ethylene biosynthesis during tomato fruit ripening.四、核蛋白酵母雜交點對點驗證簡介

五、酵母單/雙雜點對點技術優勢：1. 轉化效率高，較少假陰性；2. 設置嚴格的對照實驗，排除假陽性和假陰性；3. 酵母雙雜系統採用多個報告基因，且每個報告基因上遊調控區各不相同，可大幅度減少假陽性；4. 報告基因整合到染色體上，使基因表達水平穩定，消除了由於質粒拷貝數變化引起基因表達水平波動而造成的假陽性；5. 嚴格設置點種驗證實驗菌體生長狀態，進一步驗證是否互作及互作強弱；6. 嚴格保存原始實驗數據便於溯源。

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