【BioLABs protocol】酵母雙雜交技術原理及實驗步驟
【Protocol】酵母單雜交原理及實驗方法
X-Gal與X-α-gal有什麼不同？二者可以互相替換嗎？
X-Gal是E.coli β-半乳糖苷酶（LacZ）的反應底物，而X-α-gal是酵母α-半乳糖苷酶（MEL1）的反應底物。X-α-gal用作酵母雙雜交系統中藍白篩選的篩選標記。二者不可以互相替換。
X-α-Gal檢測酵母MEL1基因的激活。MEL1是GAL4酵母雙雜交系統的一個報告基因，編碼分泌型的α-半乳糖苷酶。該酶可水解無色的X-α-Gal底物並最終產生藍色產物。表達α-半乳糖苷酶的酵母菌落在含有X-α-Gal的培養基上顯藍色，即陽性的雙雜交作用。X-α-Gal可在培養基上直接檢測酵母雙雜交相互作用，利用此底物可以省去雙雜交體系中的β-半乳糖苷酶溶液和filter-lift assays；
X-Gal用於檢測β-半乳糖苷酶（LacZ）的活性。由於β-半乳糖苷酶不能分泌，需裂解酵母細胞後通過加入β-半乳糖苷酶溶液和filter-lift assays才能進行顯色。因此操作流程相對繁瑣。
攜帶MEL1基因的酵母菌株：Y2HGold、Y190、AH109、Y187、PG69-2A
1. X-α-gal 使用方法
一、塗布於預製平板：
1）溶解24 mg X-α-gal於6 mL DMF，終濃度為4 mg/ mL。
2）塗布200 μL(15 cm) 或者100 μL（10 cm）X-α-gal 儲存液於預製平板上；
3）置於37℃培養箱至液體被吸收（由於DMF揮發性低，最長可放4小時）；
4） 將轉化細菌或酵母塗於平板上，於37℃或30℃培養直至藍色菌落出現。
二、直接加入瓊脂中：
1）溶解60 mg X-α-gal於3 mL DMF，終濃度為20 mg/ mL。
2）將已滅菌瓊脂培養基冷卻至50-55 ℃；
3）向上述培養基中加入20 mg/ mL X-α-Gal，比例為每升培養基中加入1 mL X-α-Gal溶液。
2. X-gal使用方法（filter-lift assays）
試劑準備
16.1 g/L Na2HPO4 · 7H2O
5.50 g/L NaH2PO4· H2O
0.75 g/L KCl
0.246 g/L MgSO4· 7H2O
調節pH 7.0，高溫高壓滅菌。可室溫保存。
100 mL Z buffer
1.67 mL X-gal 儲液
0.27 mL β-mercaptoethanol
實驗流程
1. 生長2-4天的新鮮單菌落; 用鉛筆在濾紙上畫 8×8 的方格，每個方格放置一個新鮮培養的單菌落並記錄下編號;
2. 配製 Z buffer/X-gal 反應液;
3. 在乾淨平皿中鋪一張濾紙，用 Z buffer/X-gal 反應液(2.5-5 mL)將濾紙浸溼;
4. 用鑷子另取一張無菌、乾燥的濾紙，鋪在劃線培養的酵母菌表面，用鑷子輕輕滾壓，使菌轉移到濾紙表面(注:在濾紙上做好方位標記，以便識別菌種編號);
5. 當濾紙全部溼潤，用鑷子將鋪有菌落的濾紙放入液氮中速凍 30 sec，液氮需沒過菌落;
6. 取出濾紙，放置於一乾淨平皿中使其室溫解凍;
7. 用鑷子將解凍的濾紙輕輕疊放在浸有反應液的濾紙上(有菌的表面朝上)，保證兩層濾紙間沒有氣泡;30°C，培養8 h，觀察X-gal染色情況。菌落變為藍色的為陽性，超過 8 h 變藍，很有能是假陽性。
注意事項：
1. x-gal注意遮光保存。
2. 液氮冰凍菌的時候可以試試反覆凍融，這樣會使細胞破碎的更加完全一些，便於染色液的滲透。