編者按：上周我們推送了山東農大、四川農大和美國愛達荷大學共同發表的小麥條銹病抗性基因YrAS2388（Yr28）圖位克隆的文章：Nature Communications一作解讀 | 節節麥抗條銹病基因YrAS2388的圖位克隆。在文章中，作者創建了目標材料的Fosmid基因組文庫，通過篩選構建了目標基因區間的物理圖譜，並在此基礎完成了目標基因的注釋和功能驗證。有讀者給我們留言，想知道Fosmid基因組文庫構建的基本步驟。因此，我們聯繫了該文章的一作——張超中博士，邀請他就文章中Fosmid文庫的構建和篩選的步驟進行了詳細介紹。
「儘管Fosimid文庫的平均插入片段只有40Kb左右，但與BAC文庫相比，Fosimid文庫的構建不僅具有操作簡單、節省成本的優點，也克服了BAC文庫的偏好性。」
1. Fosmid基因組文庫的構建
從種植後4周的抗條銹病親本PI511383植株上收取葉片，立即放入液氮冷凍後儲存在-80℃備用。將細胞核包埋在0.5%的低熔點瓊脂糖（low-meltingagarose，LMP）膠塊中，然後在加有蛋白酶K的洗滌劑中進行核溶解來製備大片段的DNA。將每個DNA包埋塊轉移至盛有200l TE緩衝液的1.5 ml離心管中。通過約22次冷凍-解凍循環來破碎瓊脂糖中的DNA，在液氮中孵育20s，然後在45℃水浴中孵育3min為一個循環。根據CopyControl Fosmid Library Production Kit （Epicenter Technologies Corp.，Madison，WI，USA）操作手冊，經脈衝場凝膠電泳（pulse field gel electrophoresis，PFGE）後，從瓊脂糖凝膠中純化大小在33.5-63.5kb範圍內的DNA片段，經過DNA末端修復酶修復後，連接到pCC1FOS載體中，然後連接產物進行噬菌體顆粒包裝。將包裝的fosmid克隆轉化到EPI300-T1R感受態細胞中，並如操作手冊（Epicenter）中所示進行基因組文庫的濃度梯度測定。為了便於計算Fosmid克隆的數量，我們將在37℃孵育18至24h後的菌液濃度控制在以下梯度內：用200 l菌液塗板，每個平板可獲得大約1,000或2,000個克隆。使用4.2ml液體培養基（例如LB）和1.8ml的甘油混合液來收集每個平板上的菌落，並成為一個超級池；將一個超級池分裝到3個獨立的凍存管中，每個凍存管作為一個超級池的獨立備份，並儲存在-80℃備用。2. Fosmid文庫的篩選
每個超級池取2l菌液為模板，使用與目標基因緊密連鎖的3個標記對622個超級池進行PCR篩選。對於篩選得到的陽性超級池，取25ul甘油儲存液接種到加有12.5 g/ml的氯黴素5ml LB（LB-C）液體中，並在250rpm振蕩器上於37℃培養4h。使用液體LB將培養後的菌液稀釋5個濃度梯度（10-1至10-5），並將稀釋後的菌液（每個梯度取300l）塗布到LB-C瓊脂板上。理想的稀釋倍數是每個15cm直徑平板上產生4,000-5,000個獨立克隆。使用384複製器從平板上複製菌落，重複接觸四次以收集更多具有代表性的菌落。然後用複製器接種到盛有50l LB-C的384孔板中，將384孔板在37℃下孵育過夜後用384孔PCR儀進行菌液PCR篩選。對於384孔板上對應的陽性孔，取孔中20ul培養物接種到2 ml的液體LB-C中，並在250rpm培養箱中於37℃生長2h。使用液體LB-C將菌液稀釋4個濃度梯度（從10-1至10-4），並將每個濃度的菌液取100l培養物塗布到LB-C瓊脂平板上。理想的稀釋倍數為每個9cm直徑的平板產生50-200個獨立的克隆，經過菌落PCR篩選，在24個克隆中就可以得到至少一個陽性單克隆。通過篩選622個超級池，我們得到了來自20個超級池的陽性fosmid單克隆，其中5個克隆在3個標記上都是陽性的，2個或3個克隆在兩個標記組合上是陽性的，3個或7個僅在一個標記上是陽性的。最後，通過對陽性單克隆進行測序和de novo組裝，我們最終獲得了目標區段大約50Kb的物理圖譜。