目的DNA片段的分離與回收

　　

　　【實驗原理】

　　瓊脂糖凝膠電泳與醋酸纖維素薄膜電泳原理基本相同，但兼有分子篩效應，從而使不同分子量大小的DNA片段分離。瓊脂糖是從瓊脂中提取出來的含有較多的酸根和羥基多糖。回收DNA的方法很多，主要包括DEAE纖維素紙插片電泳法、透析袋電泳洗脫法、槽溝電泳洗脫法、v形槽電泳洗脫法以及低熔點瓊脂糖凝膠挖塊回收法。本實驗採用瓊脂糖凝膠DNA片段純化試劑盒，此試劑盒採用獨特的凝膠融解系統，結合DNA製備膜技術，具有高效、快速、方便之特點，全套操作只需要30分鐘便可完成。使用此試劑盒每次可純化得到多至10μg 的DNA片段(100bp -30kb ),回收率高達50-80%。

　　【器材】

　　1.紫外分光儀

　　2.離心機

　　【試劑】

　　1.瓊脂糖凝膠

　　2.DNA Purification Kit(Takara )

　　【操作步驟】

　　1.使用TAE緩衝液製作瓊脂糖凝膠，然後對目的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳。

　　2.在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體。

　　3.切碎膠塊。

　　4.稱量膠塊重量，計算膠塊體積(1mg =1μl)。

　　5.向膠塊中加入膠塊融化液DR-I Buffer, DR-I Buffer 的加量如下表：

　　凝膠濃度

　　DR-I Buffer使用量

　　1.0%

　　3個凝膠體積量

　　1.0-1.5%

　　4個凝膠體積量

　　1.5-2.0%

　　5個凝膠體積量

　　6.均勻混合後75℃加熱融化膠塊(低溶點瓊脂糖凝膠只需在45℃加熱)。振蕩混合，使膠塊充分融化(約6-10min)。

　　7.向上述膠塊融化液中加入DR-I Buffer 量的1/2體積量的DR-II Buffer，均勻混合。當分離小於400bp的 DNA片段時，應在此溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。

　　8.將試劑盒中的Spin Column 安置於Collection Tube上。

　　9.將上述操作7的溶液轉移至Spin Column中，3600rpm 離心1min。

　　10.將500μl 的Rinse A 加入Spin Column中，3600rpm 離心30Sec，棄濾液。

　　11.將700μl的Rinse B加入Spin Colum中，Spin Colum中，離心30Sec ，棄濾液。

　　12.重複操作步驟11，然後12 000 rpm再離心1min。

　　13.將Spin Column按置於1.5ml 的離心管上,在Spin Column膜的中央處加入25μl的水或洗脫液,室溫靜置1min。

　　14.12 000 rpm離心1min 洗脫DNA。

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