【實驗目的】
（1）掌握割膠回收外源DNA的原理。
（2）掌握瓊脂糖凝膠電泳割膠回收外源DNA片段的方法及操作步驟。
【實驗原理】
DNA經瓊脂糖凝膠電泳後，切下要回收的含DNA的瓊脂塊，採用DNA膠回收試劑盒回收DNA。DNA膠回收試劑盒包括DNA凝膠熔化液、DNA洗滌液和DNA洗脫液。其原理是：瓊脂糖凝膠塊在凝膠熔化液（溶液Ⅰ）中被迅速熔化並釋放出DNA，DNA片斷被選擇性吸附到矽膠膜上，經DNA洗滌液（溶液Ⅱ）洗滌去除殘留在矽膠膜上的雜質和高濃度鹽離子後，吸附到矽膠膜上的DNA片斷經微量水或DNA洗脫液（溶液Ⅲ）洗脫下來。該方法回收率高且不降解DNA，操作簡單、快速、方便，純化的DNA適合於任何分子生物學操作（如酶切、克隆、測序等）。此方法也適用於去除鹽、有機溶劑、未反應的寡核苷酸、引物、引物二聚體標記或PCR反應中的酶。
【實驗材料、試劑及儀器】
1．實驗材料
PCR擴增產物50μL，或酶切後釋放小片段DNA的重組質粒。
2．實驗試劑
DNA膠回收試劑盒：購自上海生工生物工程技術服務有限公司。試劑盒中包括凝膠熔化液（溶液Ⅰ）、DNA洗滌液（溶液Ⅱ）和DNA洗脫液（溶液Ⅲ）。
3．實驗儀器
臺式高速離心機（每8人1臺）
恆溫水浴鍋（每8人1臺）
1．5mL無菌離心管（每人4支）
移液器（每2人1套）
200μL、1mL無菌吸頭（若干）
【實驗步驟】
（1）1.4％瓊脂糖凝膠電泳（教師完成）。
（2）用手術刀將目的DNA片段的瓊脂塊割下，稱量瓊脂塊的重量。
（3）將瓊脂塊放在離心管內用1mL槍頭搗碎，加入等體積的溶液Ⅰ（如膠為100mg，則加100μL溶液Ⅰ），顛倒混勻，50～60℃水浴加熱約10min至膠全熔。其間，需顛倒混勻三四次，以加速凝膠熔解。如果膠碎片較小，3～5min即可全熔；凝膠碎片較大，則需較長時間，膠全熔後至少再50～60℃水浴加熱2min。
（4）將膠加入到DNA純化柱內，室溫放置1min後，最高速（16000g左右）離心1min，倒棄收集管內的液體。（註：這一步一定要達到16000g，較低離心速度會導致回收效率下降。）
（5）在DNA純化柱內加入700μL溶液Ⅱ，室溫放置1min後，最高速離心1min，洗去雜質，倒棄收集管內的液體。
（6）再加入500μL溶液Ⅱ，最高速離心1min，進一步洗去雜質，倒棄收集管內的液體。最高速再離心1min，除去殘留液體，並讓殘留的乙醇充分揮發。
（7）將DNA純化柱置於1.5mL離心管上，加入30μL溶液Ⅲ至管內柱面上，放置5min後，最高速離心1min，所得液體即為高純度DNA。
【實驗注意事項】
（1）進行步驟（4）時，如果樣品體積較大，DNA純化柱內容納不下，可以先把部分樣品加入到純化柱內，經離心處理後，再加入剩餘的樣品繼續處理。
（2）進行步驟（7）時，溶液Ⅲ需要直接加至管內柱面中央，使液體被純化柱吸收（如果不慎將溶液Ⅲ沾在管壁上，一定要震動管子，使液體滑落到管底，以便被純化柱吸收。也可用重蒸水或MiliQ級純水替代溶液Ⅲ，但是水的pH應不小於6.5），再放置較長時間（如3～5min），會對提高產量略有幫助。
【典型實驗結果分析】
圖11.3 瓊脂糖凝膠回收DNA片段M：DNA分子大小標準參照物；
1：純化後的PCR產物
理想實驗結果（見圖11.3）
得到與預期大小一致的目的片段，條帶清晰，無雜質。
【實驗討論】
問題1：瓊脂糖凝膠的多少對實驗結果有無影響？
答：採用熔膠法來純化DNA時，必須將瓊脂糖凝膠完全熔解。因此，若瓊脂糖凝膠量過多，不僅增加了熔膠液的用量，而且不利於凝膠的完全熔解，會影響後續的操作；若凝膠量過少，則所含的DNA量就少，獲得的DNA量也少。
問題2：本實驗對DNA的量有無限制？
答：DNA純化柱對所結合的DNA量有一定的限制，因此，採用此方法時，DNA的量不可過多，也不可過少。若DNA量過少，則達不到DNA純化柱的最大結合量，浪費了DNA柱子；若DNA的量過多，則超出了DNA純化柱的最大結合量，減少了DNA得率。