通過聚丙烯醯胺或高解析度瓊脂糖凝膠電泳對回收DNA定性和定量

2020-12-04 果果廚房

12.通過聚丙烯醯胺或高解析度瓊脂糖凝膠電泳對回收DNA進行定性和定量。i.取少量最終製備得到的DNA片段(約20ng)與10μLTE (pH 8.0)溶液混合，加入2μL所需的凝膠加樣緩衝液。

ii.在適當濃度的聚丙烯醯胺或高解析度瓊脂糖凝膠.上進行樣品電泳，用已知數量的，原始DNA的酶切消化產物作為示蹤標準品。回收的DNA片段應與示蹤標準品中的相應酶切片段具有同步遷移率。

ii.仔細檢查電泳凝膠，觀察是否存在其他汙染DNA的弱螢光條帶。常常可以通過比較回收DNA目的條帶和示蹤標準品條帶的相對螢光強度估計最終DNA量。回收的DNA條帶很少需要進一步純化。

對於長度<100bp的寡核苷酸和DNA片段，最佳選擇是採用市售的陰離子交換樹脂色譜法進行純化[例如QLAGEN-tips: DNAPac (Dionex)]。在Souther印跡中，DNA要經過一種或多種限制性內切核酸酶的消化，消化後的片段在標準的瓊脂糖凝膠上經電泳按照大小進行分離。

DNA經過原位變性後，從凝膠轉移到固相支持物上(通常為尼龍膜或者硝酸纖維素膜)。DNA片段的相對位置在向膜轉移的過程中保持不變。然後將DNA固定於膜上，並按照方案12所述方法準備進行雜交。

本方案中還介紹了一種同時轉移兩塊膜的方法。Southerm 印跡中向上轉移DNA的步驟參見「RNA向尼龍膜轉移」所述(第6章，方案12)。

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