血清蛋白瓊脂糖凝膠電泳

2021-01-08 生物谷

【原理】

瓊脂糖(agarose)是經過挑選,以質地較純的瓊脂(agar)作為原料而製成的。瓊脂在化學上是由瓊脂糖和瓊脂膠組成的複合物。瓊脂膠是一含有硫酸根和羥基的多糖,它具有離子交換性質,這種性質會給電泳及凝膠過濾以不良的影響。瓊脂糖是直鏈多糖,它由D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖的殘基交替排列組成。

瓊脂糖主要通過氫鍵而形成凝膠。電泳時因凝膠含水量大(98-99%),近似自由電泳,因為固體支持物的影響少,故電泳速度快,區帶整齊。而且由於瓊脂糖不含帶電荷的基團,電滲影響很少,是一種較好的電泳材料,分離效果較好。

血清中脂類物質與血清載脂蛋白結合成水溶性的脂蛋白(lipoprotein)形式存在。各種脂蛋白中所含載脂蛋白的種類及數量不同,各種脂蛋白顆粒大小也相差很大,因此,以瓊脂糖凝膠為支持物,在電場中可使各種脂蛋白顆粒分離開來。



瓊脂糖凝膠電泳分離血清蛋白方法簡單。將血清脂蛋白用脂類染料蘇丹黑(或油紅等)進行預染。再將預染過的血清加樣於瓊脂糖凝膠板加樣槽中,通電後可以看到脂蛋白向正極移動,並分離出幾個區帶。
正常人血清脂蛋白可出現三條區帶,從陰極到陽極依次為β-脂蛋白(最深),前β-脂蛋白(最淺)及α-脂蛋白(比前β-脂蛋白略深些),在原點處應無乳糜微粒。有時前β-脂蛋白也顯
示不出來。

瓊脂糖主要通過氫鍵而形成凝膠。電泳時因凝膠含水量大(98-99%),近似自由電泳,因為固體支持物的影響少,故電泳速度快,區帶整齊。而且由於瓊脂糖不含帶電荷的基團,電滲影響很少,是一種較好的電泳材料,分離效果較好。

血清中脂類物質與血清載脂蛋白結合成水溶性的脂蛋白(lipoprotein)形式存在。各種脂蛋白中所含載脂蛋白的種類及數量不同,各種脂蛋白顆粒大小也相差很大,因此,以瓊脂糖凝膠為支持物,在電場中可使各種脂蛋白顆粒分離開來。

瓊脂糖凝膠電泳分離血清蛋白方法簡單。將血清脂蛋白用脂類染料蘇丹黑(或油紅等)進行預染。再將預染過的血清加樣於瓊脂糖凝膠板加樣槽中,通電後可以看到脂蛋白向正極移動,並分離出幾個區帶。
正常人血清脂蛋白可出現三條區帶,從陰極到陽極依次為β-脂蛋白(最深),前β-脂蛋白(最淺)及α-脂蛋白(比前β-脂蛋白略深些),在原點處應無乳糜微粒。有時前β-脂蛋白也顯示不出來。

【操作】

1、預染血清  血清0.2mL中加蘇丹黑染色液0.2mL,混合置37℃水浴中染色30分鐘,離心(2000轉/分)約5分鐘。以除去懸浮於血清中染料沉渣。
2、製備瓊脂糖凝膠板  將已配製好的0.5%瓊脂糖凝膠於沸水浴中加熱融化,用吸管吸取凝膠溶液澆注在載玻片上,約3 mL。靜置半小時後凝固(天熱時需延長,也可放入冰箱中數分鐘以加速凝固)。
3、點樣  將剪好的濾紙條對摺,以折邊在距凝膠一端2cm處切一點樣口。將毛細管插入預染好的血清中,待吸入部分血清後,取毛細管使其有樣品的一端靠於點樣口端部,停靠3秒左右。
4、電泳  將凝膠板平放入電泳槽中,使加樣端接在陰極一側,用四層濾紙或紗布做成「引橋」,敷於膠板的兩端,各搭住凝膠板約1cm左右,「引橋」的另一端浸於電泳槽內的巴比妥緩衝液中。接通電源,首先調節電流為3-4mA/凝膠板,電泳10-15分鐘;然後調節電流為6-7mA/凝膠板,電泳30-40分鐘,即可觀察到分離的區帶。
5、如果需要保留電泳圖譜,可將電泳後的凝膠板(連同載玻片)放入清水中浸泡脫鹽2小時,然後放烘箱(80℃左右)中烘乾即可。

【試劑】

1、蘇丹黑染色液  將蘇丹黑B加到無水乙醇中至飽和,搖蕩使乙醯化。用前過濾。
2、巴比妥緩衝液  稱取巴比妥鈉15.4g、巴比妥2.76g及EDTA0.29g,加水溶解後再加蒸餾水至1000mL(pH為8.6,離子強度0.075),為電極緩衝液。
3、凝膠緩衝液  取三羥甲基氨基甲烷1.212g、EDTA0.29g及NaCl5.85g,用蒸餾水溶解後,稀釋至1000mL,pH為8.6。
4、瓊脂糖凝膠  稱取瓊脂糖0.45 g溶於50 mL凝膠緩衝液中,再加水  50 mL。在水浴中加熱至沸,待瓊脂糖完全溶解後,立即停止加熱。

【注意事項】

1、電泳樣品應為新鮮的空腹血清。
2、加熱溶化瓊脂時,須防止水份蒸發過多。瓊脂糖凝膠最好隨用隨制,以免凝膠表面乾燥,影響分離效果。
3、製作凝膠板時瓊脂糖濃度一般選用0.5%左右為宜,高於1%以上α-脂蛋白部分較緊密,β和前β-脂蛋白部分不夠清晰;低於4.5%則凝固性較差,圖譜不清。
4、點樣口要大小適宜,邊緣整齊、光滑,否則會影響電泳圖譜。
5、在α-脂蛋白前若出現較淺區帶,可列為前α-脂蛋白。
【正常參考範圍】
α-脂蛋白   20~30%
β-脂蛋白 20~30%
前β-脂蛋白 0~28%
乳糜微粒(-)

相關焦點

  • 血清蛋白電泳
    檢測方法血清電泳的檢測方法有多種,有Tiselius自由電泳,醋酸纖維素膜電泳,瓊脂糖凝膠電泳,澱粉膠電泳,聚丙烯醯胺凝膠圓盤電泳,濃度梯度板狀膠電泳,微型雙向電泳,毛細管電泳等。電泳方法不同,分離血清蛋白的能力則有很大差異。
  • 瓊脂糖凝膠電泳原理
    瓊脂糖凝膠電泳原理瓊脂糖凝膠電泳,是以瓊脂糖為介質,對不同大小的DNA 或 RNA 實現分離的一種電泳方法
  • 為什麼我們要用瓊脂糖凝膠做電泳載體?
    常用的電泳實驗載體:1、醋酸纖維素薄膜電泳 :醋酸纖維素薄膜電泳是以醋酸纖維素薄膜為支持物,它是纖維素的醋酸酯,由纖維素的羥基經乙醯化而製成。2、 瓊脂糖凝膠電泳 :瓊脂糖凝膠電泳是一種以瓊脂糖凝膠為支持物的凝膠電泳。
  • 瓊脂糖凝膠電泳
    【基本原理】   瓊脂糖凝膠電泳是分離、純化、鑑定DNA片段的常用方法,具有簡便、快速的優點。DNA瓊脂糖凝膠電泳的原理與蛋白質的電泳原理基本相同,DNA分子在高於其等電點的溶液中帶負電荷,在電場中向正極移動。DNA 分子在電場中通過介質而泳動,除電荷效應外,凝膠介質還有分子篩效應,與分子大小及構象有關。
  • DNA的瓊脂糖凝膠電泳
    在瓊脂糖凝膠中電泳時,由於瓊脂糖凝膠具有一定孔徑,長度不同的DNA分子由於所受凝膠的阻遏作用大小不一,遷移的速度不同,從而可以按照分子量大小得到有效分離。溴化乙錠可插入到DNA分子的雙鏈中。在紫外光的照射下,插入溴化乙錠的DNA呈橙紅色螢光,所以溴化乙錠可以作螢光指示劑指示DNA含量和位置。   二、材料、儀器設備及試劑   (一)材料:分子量不同的DNA片段。
  • 瓊脂糖凝膠電泳實驗
    【實驗目的】 (1)學習瓊脂糖凝膠電泳的基本原理; (2)掌握使用水平式電泳儀的方法; (3)學習在含有甲醛的凝膠上進行RNA電泳的方法。   【實驗原理】 瓊脂糖凝膠電泳是基因工程實驗室中分離鑑定核酸的常規方法。
  • 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術
    [目的要求]   通過本實驗學習瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術   [實驗原理]   瓊脂糖凝膠電泳是分離鑑定和純化DNA片段的常用方法。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應,DNA分子在高於等電點的pH溶液中帶負電荷,在電場中向正極移動。
  • 瓊脂糖凝膠電泳鑑定DNA
    【實驗目的】 通過實驗掌握瓊脂糖凝膠電泳鑑定DNA的原理與方法。 【實驗原理】 瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種雜聚多糖,是由D型和L型半乳糖以α-1,3和β-1,4糖苷鍵相連形成的線狀高聚物(如下圖所示)。
  • DNA的瓊脂糖凝膠電泳簡介
    DNA的瓊脂糖凝膠電泳簡介 來源:來源網絡 2007-02-08 21:13 瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要是依據它們的相對分子量質量及分子構型
  • 瓊脂糖凝膠電泳及其影響因素
    此外,還可以從電泳後的凝膠中回收特定的DNA條帶,用於以後的克隆操作。瓊脂糖和聚丙烯醯胺可以製成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小範圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200 bp 至近50 kb 的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恆定的電場下電泳。聚丙烯醯胺分離小片段DNA(5-500 bp)效果較好,其分辯力極高,甚至相差1bp的DNA片段就能分開。
  • RNA瓊脂糖凝膠電泳實驗方法
    RNA瓊脂糖凝膠電泳實驗方法一、實驗目的掌握植物總RNA非變性膠電泳的原理和方法。二、實驗原理RNA電泳可以在變性及非變性兩種條件下進行。非變性電泳使用1.0%--1.4%的凝膠,不同的RNA條帶也能分開,但無法判斷其分子量。只有在完全變性的條件下,RNA的泳動率才與分子量的對數呈線性關係。因此要測定RNA分子量時,一定要用變性凝膠。在需快速檢測所提總RNA樣品完整性時,配製普通的1%瓊脂糖凝膠即可。 三、實驗材料、器具及藥品蘑菇的總RNA溶液。
  • 知識分享:瓊脂糖凝膠電泳
    知識分享:瓊脂糖凝膠電泳實驗原理瓊脂糖凝膠電泳常用於分離、鑑定 DNA、RNA 分子混合物,以瓊脂凝膠作為支持物,利用 DNA 分子在電場中時的電荷效應和分子篩效應,達到分離混合物的目的。DNA 分子在高於其等電點的溶液中帶負電,在電場中由陰極向陽極運動。
  • 水平式瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA
    水平式瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA 來源:來源網絡 2007-03-27 21:37 實驗目的   學習水平式瓊脂糖凝膠電泳檢測
  • 質粒DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳
    質粒DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳 來源:來源網絡 2007-03-14 22:30 (一)鹼變性法提取質粒DNA   質粒(Plasmid
  • 「實驗」質粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢
    一、實驗目的1.掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理2.掌握瓊脂糖凝膠的製作和電泳檢測的方法二、實驗原理1.DNA瓊脂糖凝膠電泳的原理瓊脂糖是一種線性多糖聚合物,天然聚合長鏈狀分子,在沸水中溶解,45℃開始形成多孔性剛性濾孔,凝膠孔徑的大小取決於瓊脂糖的濃度,濃度越高,孔隙越小,其分辨能力就越強。
  • 外源DNA的瓊脂糖凝膠電泳回收
    (2)掌握瓊脂糖凝膠電泳割膠回收外源DNA片段的方法及操作步驟。 【實驗原理】 DNA經瓊脂糖凝膠電泳後,切下要回收的含DNA的瓊脂塊,採用DNA膠回收試劑盒回收DNA。DNA膠回收試劑盒包括DNA凝膠熔化液、DNA洗滌液和DNA洗脫液。
  • 瓊脂糖凝膠電泳實驗_中國教育裝備採購網
    【實驗目的】 (1)學習瓊脂糖凝膠電泳的基本原理; (2)掌握使用水平式電泳儀的方法; (3)學習在含有甲醛的凝膠上進行RNA電泳的方法。   【實驗原理】 瓊脂糖凝膠電泳是基因工程實驗室中分離鑑定核酸的常規方法。
  • 質粒DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳——萬融實驗
    【實驗原理】細菌培養物加入SDS和NaOH鹼性溶液處理後,菌體裂解,可使細菌的質粒DNA、染色體DNA和RNA一起從細胞內釋放出來,經瓊脂糖凝膠電泳,因各種核酸分子的遷移率不同將上述核酸分成不同的帶。用溴化乙啶(EB)染色後,在紫外線燈下可看到各種核酸帶發出的螢光。根據螢光的位置,可區分不同的核酸帶。
  • 電泳知識小課堂---瓊脂糖凝膠電泳
    關於瓊脂糖凝膠電泳的實驗技巧和方法以及注意事項1 )加樣時槍頭不要碰壞凝膠壁,否則DNA的帶型將不會整齊,加樣前要用槍頭吸打凝膠孔中的溶液 ,以趕走樣品空中的氣泡。2 )每孔最大DNA.上樣量決定於DNA樣品片段的大小、數目及樣品孔形狀與容量。
  • 血清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳
    Ø 按支持介質不同可將電泳分為紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯醯胺凝膠電泳 Ø 另外,還可以按分離原理不同、支持介質形狀不同、用途不同以及所用電壓不同等將電泳分類 Ø 電泳的裝置主要包括兩個部分:電源和電泳槽。