DNA的瓊脂糖凝膠電泳簡介

2020-12-01 生物谷

DNA的瓊脂糖凝膠電泳簡介

來源：來源網絡 2007-02-08 21:13

瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要是依據它們的相對分子量質量及分子構型，同時與凝膠的濃度也有密切關係。
1、核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關係
（1）DNA分子的大小 在凝膠中，DNA片段遷移距離（遷移率）與鹼基對的對數成反比，因此通過已知大小的標準物移動的距離與未知片段的移動距離時行比較，便可測出未知片段的大小。但是當DNA分子大小超過20kb時，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時電泳的遷移率不再依賴於分子大小，因此，就用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時，分子大小不宜超過此值。
（2）瓊脂脂糖的濃度 如下表所示，不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。

        表 瓊脂糖濃度與DNA分離範圍
瓊脂糖濃度 /%    0.3    0.6    0.7    0.9    1.2    1.5    2.0
線狀DNA大小/kb  60-5  20-1  10-0.8  7-0.5  6-0.4  4-0.2  3-0.1

2、核酸構型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關係
    不同構型DNA的移動速度次序為：供價閉環DNA（covalently closed circular，cccDNA）>直線DNA>開環的雙鏈環狀DNA。當瓊脂糖濃度太高時，環狀DNA（一般為球形）不能進入膠中，相對遷移率為0（Rm=0），而同等大小的直線雙鏈DNA（剛性棒狀）則可以長軸方向前進（Rm>0），由此可見，這三種構型的相對遷移率主要取決於凝膠濃度，但同時，也受到電流強度、緩衝液離子強度等的影響。
3、電泳方法
（1）凝膠類型
    用於分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型（平板型）。水平型電泳時，凝膠板完全浸泡在電極緩衝液下1-2mm，故又稱為潛水式。目前更多用的是後者，因為它制膠和加樣比較方便，電泳槽簡單，易於製作，又可以根據需要製備不同規格的凝膠板，節約凝膠，因而較受歡迎。
（2）緩衝液系統
    缺少離子時，電流太小，DNA遷移慢；相反，高離子強度的緩衝液由於電流太大會大量產熱，嚴重時，會造成膠熔化和DNA的變性。
常用的電泳緩衝液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TEA），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，濃度約為50mmol/L(pH7.5~7.8)。電泳緩衝液一般都配製成濃的貯備液，臨用時稀釋到所需倍數。
TAE緩衝能力較低，後兩者有足夠高的緩衝能力，因此更常用。TBE濃溶液長期貯存會出現沉澱，為避免此缺點，室溫下貯存5×溶液，用時稀釋10倍0.5×工作溶液即能提供足夠緩衝能力。
（3）凝膠的製備
    以稀釋的電極緩衝液為溶劑，用沸水浴或微波爐配製一定濃度的溶膠，灌入水平膠框或垂直膠膜，插入梳子，自然冷卻。
（4）樣品配製與加樣
    DNA樣品用適量Tris-EDTA緩衝液溶解，緩衝液內含有0.25%溴酚藍或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油，以增加其比重，使樣品集中。為避免蔗糖或甘油可能使電泳結果產生U形條帶，可改用2.5%Ficoll（聚蔗糖）代替蔗糖或甘油。
（5）電泳
    瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實驗條件的研究結果表明，在低濃度、低電壓下，分離效果較好。在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是，在電場強度增加時，較大的DNA片段遷移率的增加相對較小。因此隨著電壓的增高，電泳解析度反而下降，為了獲得電泳分離DNA片段的最大解析度，電場強度不宜高於5V/cm。
    電泳系統的溫度對於DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒有顯著的影響。通常在室溫下進行電泳，只有當凝膠濃度低於0.5%時，為增加凝膠硬度，可在4℃進行電泳。
（6）染色和拍照
    常用螢光染料溴乙錠（EB）染色，在紫外光下觀察DNA條帶，用紫外分析儀拍照，或用凝膠成像系統輸出照片，並進行有關的數據分析。


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