恆溫核酸檢測技術新突破——SM@RT

RPA全稱重組酶聚合酶擴增技術（Recombinase Polymerase Amplification），被譽為核酸檢測領域的革命性創新，它是由Piepenburg等在2006年建立的一種等溫核酸擴增方法，最佳溫度為37℃~42℃，擴增反應所需時間少於30 min。這些特點可以讓RPA反應無需昂貴的儀器設備，能夠在非實驗室條件下進行核酸的快速擴增，結合目前已有的簡便核酸檢測方法，就能讓RPA技術能夠在野外或者現場進行流行病的診斷，癌症篩查、食品安全檢測等等。RPA試劑上市以後受到了業內研究人員的追捧，短短7年時間關於RPA技術的SCI論文已經達到了420多篇。體外診斷領域的從業人員和研究人員對RPA技術無人不知，並普遍認為RPA技術在將來是代替PCR技術的最佳選擇。

RPA擴增DNA原理圖. （Boyle 等，2014）

2017年，基因編輯大師、美國科學院院士張鋒團隊基於RPA技術開發了一種SHERLOCK（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing）（圖）的診斷平臺，並在國際頂尖期刊《科學》在線發表了相關論文。次年4月，與張峰教授同一研究所的Sabeti團隊基於SHERLOCK結合HUDSON（Heating Unextracted Diagnostic Samples to Obliterate Nucleases, 即對未提取的診斷樣品進行加熱來消除核酸酶）建立了可以直接檢測唾液或血液等體液樣品中病原的方法，相關論文同樣發表在《科學》上。這兩篇論文的發表引起了業界的廣泛關注，因為SHERLOCK進行核酸檢測時只需要一張試紙條，在沒有任何電力設備的情況下，只要有樣品，普通人就能在現場顯示出病原感染、癌症篩查等的檢測結果，非常易於使用。

SHERLOCK原理圖（Jonathan 等，2017）

然而，中美貿易戰陰雲密布，美國針對中國的特別301調查，以智慧財產權問題發難，指責中國不公平收購美國技術的行為和政策，構築非關稅壁壘，挑起貿易戰。中美貿易戰和專利壁壘，讓RPA和SHERLOCK技術無法成為中國科研機構和醫療系統放心引進和利用的技術，同時國外供貨也成為問題，不僅價格昂貴，而且可能不能滿足市場需求。這就需要國內的科研機構和企業自主創新，研發具有自主智慧財產權的核心技術。

值得慶幸的是，2017年我國蘇州先達基因科技有限公司的一批具備豐富實踐經驗的分子生物學與酶學工程專家們，通過自主研發，結合T4噬菌體侵入細菌後的自身DNA快速複製的原理，利用抗體製藥領域的Direct evolution等先端技術，研發了具有全球自主智慧財產權的SM@RT恆溫核酸檢測方法，該方法低溫條件下（25-42℃）可對痕量的靶DNA片段進行特異性的擴增，在最適溫度35-40℃時，擴增反應時間僅需15分鐘，其低溫適應性和靈敏度等方面相比RPA技術產品有了新的突破，而且擺脫美國專利壁壘。

SM@RT技術DNA複製原理

我們對國內外主流恆溫擴增技術產品進行了試驗比較，結果顯示先達基因的SM@RT技術要明顯優於其它的國內外恆溫擴增技術。

一、擴增能力對比

我們實驗比較了英國的RPA技術產品、國內的RAA技術產品以及SM@RT技術產品對3000萬拷貝數質粒（高拷貝的靶基因）和3000拷貝數質粒（中拷貝的靶基因）的擴增效果進行了橫向比較（對比結果見圖1）。通過比較我們看到SM@RT技術產品在3000萬拷貝數質粒（高拷貝的靶基因）和3000拷貝數質粒（中拷貝的靶基因）的擴增效果都高於國內的RAA技術產品。

圖1 擴增試劑對比試驗

（說明：1、2-3：SM@RT技術產品； 3、4：為RPA技術產品；5、6：RAA技術產品；1、2、5模板濃度為3000萬拷貝數；3、4、6 ：模板濃度為3000拷貝數；7、8：NTC）

二、某病原體樣本檢測對比試驗

我們對實驗室同一株細胞樣本，利用英國的RPA技術產品、國內的RAA技術產品以及SM@RT技術產品對某病原體進行檢測（對比結果見圖2）。通過等溫擴增螢光檢測對比，以螢光值達到4000為判定線，RAA技術產品需要15分鐘，RPA技術產品需要12分鐘，SM@RT技術產品需要9分鐘，通過達到同一螢光值用時長短比較，我們可以看到SM@RT技術產品擴增至相同螢光值所用時間少於英國的RPA技術產品和國內RAA技術產品，說明SM@RT技術產品的擴增能力要優於其他兩種技術產品。

圖2 支原體等溫擴增螢光檢測對比試驗

（說明：1-3：測試支原體感染的細胞樣本；4-6：陰性對照；1,4:SM@RT技術產品； 2,5：RPA技術產品； 3,6:RAA技術產品）

三、靈敏度檢測試驗

我們又對SM@RT檢測技術靈敏度進行了試驗，實驗結果如圖3，通過實驗結果可以看出SM@RT技術產品在只有30個靶基因拷貝的情況下仍然能夠被檢測到，這與高品質的螢光定量PCR技術的檢測靈敏度相仿，顯示出該技術在靈敏度方面表現是非常優秀的。

圖3 SM@RT技術產品的靈敏度試驗

（說明：1：模板量為30000拷貝數；2：模板量為3000拷貝數；3：模板量為300拷貝數；4：模板量為30拷貝數；5：為陰性對照）

預計將來，SM@RT核酸檢測技術在各個領域將會有巨大的應用價值。上世紀八十年代Mullis發明的聚合酶鏈式反應（PCR）開啟了分子生物學檢測技術的新篇章，而後在此基礎上發展出巢式PCR、實時螢光定量PCR（qPCR）等。等溫核酸擴增技術的發展大大提高了傳統PCR技術的實用性，以此為代表的有環介導等溫擴增技術（LAMP）、重組酶聚合酶擴增技術（RPA）。現在發展最為快速的要數RPA技術，以其高敏感性和便捷性受到全球基礎科研人員和應用研發人員的好評，被譽為可以替代PCR的核酸擴增技術。但是根據我們的實驗數據這裡的SM@RT技術要比RPA的靈敏度更高，擴增效率更高。這標誌著我國在DNA分子檢測技術上已經逐步趕超國外技術水平，將站在了世界的前列。將來基於SM@RT等溫擴增技術實時螢光定量核酸檢測技術能夠實現單分子檢測，同時結合快速一步法DNA釋放技術，這樣非常適用於現場檢測和快速檢測，相信未來，我國的核酸檢測技術會迎來巨大的市場前景。