新冠居家檢測試劑盒問世,核酸快檢方法有哪些?

2020-12-06 騰訊網

美國當地時間11月17日， FDA發布緊急使用授權（EUA），首批可提供快速檢測結果的「新冠居家自檢測試盒」！30分鐘內即可鑑定自己是否感染新冠病毒。而後，12月1日，國內CRISPR免疫層析法新冠病毒檢測試劑盒獲批，盤點後疫情時代新冠核酸快檢方法有哪些？

截至2020年12月2日，全球累計新冠確診病例超過6284萬例，累計死亡病例超過146萬，11月以來，全球單日新增新冠確診病例連創新高。約翰斯·霍普金斯大學統計數據顯示，全球累計確診病例10月19日超過4000萬例，11月8日超過5000萬例，從4000萬例升至5000萬例耗時20天，從5000萬例升至6000萬例耗時僅17天。北半球隨著天氣漸漸轉冷，確診病例的增長速度加快。

那麼，減少人員流動以降低感染風險，同時減輕醫檢單位的壓力，核酸快檢或將成為最有效的新冠檢測方式之一。

LAMP技術

盤點核酸快檢方法，RT-LAMP或是最快捷，成本最低的方法了。2000年日本學者Notomi在Nucleic Acids Res雜誌上公開了一種新的適用於基因診斷的恆溫核酸擴增技術，即環介導等溫擴增技術英文名稱為「Loop-mediated isothermal amplification(LAMP)」。BST DNA聚合酶是該技術的關鍵酶，利用其強的鏈置換活性和DNA聚合活性，在恆溫條件下，快速、高效、特異性的擴增模板，並且由於DNA擴增過程中產生的焦磷酸鹽形成白色沉澱而使反應結果可視化。

目前，該技術已成功地應用於SARS、禽流感、HIV等病毒疾病的檢測中。此次美國快批上市的新冠居家自檢試劑盒就是利用該技術。

LAMP技術的優點：靈敏度高，相較於傳統PCR方法高2～5個數量級；反應時間短，可30～60分鐘完成反應；臨床使用不需要特殊的儀器；操作簡單，所有組分集於一管，置於水浴鍋或恆溫箱中63℃左右保溫即可，肉眼可直接觀察檢測結果。

近岸蛋白質提供以下

LAMP產品

針對DNA或RNA病毒類型，LAMP方法均可達到理想的檢測結果。近岸蛋白質BST 2.0及RT-LAMP試劑經過多方驗證，能夠高產擴增極低量DNA、RNA。

更有超靈敏指示劑式RT-LAMP mix，可檢測低至1fg級別RNA樣本。

CRISPR技術

21世紀，CRISPR技術可謂是最火的生物技術之一，今年10月剛剛頒布的諾貝爾化學獎給到兩位先驅人物埃馬紐爾·夏彭蒂耶和詹妮弗·杜德納以表彰她們在基因編輯技術的貢獻更是證明了這一點。該技術最初是根據古細菌的自我保護機制開發，利用Cas相關蛋白編輯切除非我基因以達到對入侵者的殺傷作用。近幾年CRISPR/Cas9基因編輯技術也日趨成熟，已經開始走進人類疾病治療中。Cas系列蛋白的深度開發中，Cas12、Cas13和Cas14的發現，讓CRISPR技術應用於診斷成為可能。它們普遍存在第二個酶活結構域，當蛋白正確結合併切割特定核酸序列後，能夠激活這一結構域，切割報告分子，實現從待檢序列信息到可檢測信號的轉化。

Cas13a

2017年4月，張鋒團隊在SCIENCE上發表文章，闡述了將Cas13a與等溫擴增結合，建立了一種基於CRISPR的診斷方法(CRISPR-Dx)，提供具有attomolar級別敏感性和單鹼基錯配特異性的快速DNA或RNA檢測。該研究使用這個基於cas13a的分子檢測平臺（Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing, SHERLOCK)來檢測寨卡病毒和登革熱病毒的特定菌株，區分致病菌、人類基因型DNA，並識別無細胞腫瘤DNA的突變。

Cas13d

2018年，Salk生物研究所和Arbor Biotechnologies公司（張鋒是創始人之一）的研究人員通過常用的生物信息學篩選，在推定的效應核酸酶附近尋找CRISPR重複序列，鑑定出Cas13d蛋白並報導了Cas13d的詳細分子結構。

Cas12a

2018年4月，Jennifer Doudna團隊在SCIENCE上發表文章，闡述了將Cas12a與等溫擴增結合，建立了一種DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter (DETECTR)的方法，達到了DNA檢測的最高靈敏度。DETECTR能夠在患者樣本中快速、特異地檢測到人乳頭瘤病毒（HPV），從而為分子診斷提供了一個簡單的平臺。

近岸蛋白質提供以下

CRISPR診斷蛋白

Cas12a

Cas12a切割dsDNA活性

Cas12a切割ssDNA活性

Cas13a

LwCas13a切割效率

Cas13d

UrCas13d切割效率

TMA技術

同樣為恆溫擴增技術的還有轉錄介導的擴增技術（transcription mediated amplification，TMA），該技術由Gen-Prob研發，利用T7 RNA聚合酶和逆轉錄酶在約42℃等溫反應條件下擴增樣本。其原理是逆轉錄酶利用帶有T7啟動子的引物將RNA樣本逆轉錄成cDNA，然後RNaseH將cDNA-RNA雜鏈中RNA消化後，T7 RNA聚合酶可將含有T7啟動子的cDNA轉錄成RNA，一分子DNA模板轉錄得到100-1000拷貝的RNA，而這些RNA又再次進入反應成為TMA的起始模板。如此循環，RNA稱指數增長，在15-30min內將靶序列擴增1010左右。

與LAMP及PCR技術相比，TMA最大的優勢在於不會產生假陽性，其次是擴增效率高，易於實現自動化。

近岸蛋白質經過系列優化調整，完成了TMA的實時螢光檢測，對RNA模板進行梯度稀釋後進行TMA擴增，結果可對0.1pg RNA實現有效擴增。

進入冬天開始，縱觀國內外疫情，當前國內暫時呈現小範圍零星確診，國外氛圍依舊緊張，我們未來面對的壓力只會越來越大，「新冠居家自檢測試盒」的上市在當前情況下，無疑為大家提供了一套安全、便捷的檢測系統，未來在實現全民免疫之前，居家檢測或將成為人們快速自檢的新方式。

近岸蛋白質核酸快檢相關產品

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供稿：Bonnie

編輯：As素 | 校對：Ryan | 責編：孫旭光

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