第一鏈cDNA會作為模板,通過基因特異性引物和接頭引物得以擴增

2020-11-25 小影看劇說

RLM-RACE操作簡述如下。1. Poly(A)t RNA製備產物首先使用小牛腸磷酸酶去除汙染rRNA、tRNA和RNA片段5'端磷酸殘基。脫磷酸化的RNA在後續RNA連接酶作用下不能進行連接反應。

2.用酚-氯仿抽提法去除磷酸酶，RNA 產物再用菸草酸焦磷酸酶處理，其目的是水解帽子結構區三磷酸鍵橋上的磷酸酐鍵並暴露出一個5'端磷酸殘基。這樣脫帽後的mRNA就變成噬菌體T4編碼的RNA連接酶的底物。

3.因為化學合成的寡聚核苷酸在5'端含有一個5'羥基，可使用T4編碼的RNA連接酶把寡聚核苷酸(通常為30~40 個核苷酸)連接到mRNA脫帽後暴露出來的5'磷酸基團上，連接上的寡聚核苷酸可作為下一步PCR的接頭.

4. 寡聚核苷酸-RNA嵌合體作為模板合成第一鏈cDNA, 引物可以使用隨機八聚體或十聚體引物。

5.延伸至嵌合RNA5'端的第一鏈cDNA會攜帶一個和它3'端寡核苷酸互補的序列。在熱啟動PCR中，第一鏈cDNA會作為模板，通過基因特異性引物和接頭引物得以擴增。只有在其5'端含有接頭序列的cDNA才能被擴增。

6.通過樹脂吸附和洗脫方法純化擴增產物(如Promega公司的WizardPCR試劑盒),而後克隆入質粒載體。

SMARTer RACE Clontech公司的SMARTer RACE試劑盒避免了接頭連接反應，雖然不是很有效，但是在RACRPCR中是直接使用第一鏈cDNA進行PCR.步驟簡述如下。

1.第一鏈cDNA是通過改良的鎖-塢oligo (dT)引物來啟動的，在其3'端有兩個降解的核苷酸。

相關焦點

  • 擴增反應是使用通用引物AMix 和基因特異性引物來執行的
    2.第一鏈cDNA合成是在Clontech公司的SMARTScribe反轉錄酶作用下進行的，該酶是MMLV反轉錄酶的突變體。在到達RNA模板尾部時，該聚合酶會表現出末端轉移酶活性，在第一鏈cDNA的3』端加入3~5個核苷酸。
  • 反應特異性的提高源於和相同模板結合的兩套獨立的引物
    先後使用兩對引物可使循環數倍增，從而提高了PCR的靈敏度。反應特異性的提高源於和相同模板結合的兩套獨立的引物。巢氏PCR對於擴增長模板片段是一-種有效的方法，但是需要知道靶基因的序列。在「半巢氏PCR」中，第二次擴增使用的一條引物與第一次PCR中兩條外引物的其中一條完全相同(Zhang and Ehrlich 1994)。半巢氏PCR的特異性可能較常規的巢式PCR稍差，但是兩種技術在靈敏度上相近。RT-PCR是從低拷貝mRNA中合成和檢測cDNA的有效方法。
  • 通過改變第一鏈cDNA與引物的濃度,使用新dNTP來優化PCR
    總體來講，要確保在實驗中加入所有適當的陰性對照(無RNA、無反轉錄酶、無熱穩定DNA聚合酶)和陽性對照(陽性RNA對照，如果有可能)。問題(步驟2): 第一鏈cDNA產量少，原因是RNA發生降解。解決方案：通過變性瓊脂糖凝膠電泳(第2章，方案1)檢測mRNA製備的完整性和濃度。如果RNA降解，要重新製備。問題(步驟2):第一鏈cDNA產量少。RNA樣本中含有抑制反轉錄酶的成分，如SDS或胍鹽。解決方案：用乙醇重新沉澱RNA.
  • 這會極大降低汙染基因組DNA有效擴增的可能性
    問題(步驟8):擴增產物大於或小於預期片段。解決方案：可能有基因組DNA汙染。在添加或無反轉錄酶情況下進行兩步法RT-PCR。若有必要，用DNase I處理RNA樣本。必要情況下重新設計引物，這樣它們可與DNA序列的不同外顯子復性，這會極大降低汙染基因組DNA有效擴增的可能性。
  • 反義引物應該設置在引發cDNA合成的寡核苷酸的上遊
    ●cDNA 合成可用一種合成的反 義寡核苷酸引物來引發，該引物可選擇與特殊靶RNA或mRNA家族序列的某個區域雜交。特異cDNA片段能通過PCR擴增來獲得，而正義和反義寡核苷酸引物可根據cDNA具體序列來設計。
  • 消滅PCR非特異性擴增的黃金方法
    雖然度過了初學者們少加漏加PCR體系的階段，但很多奮戰在實驗室一線的小夥伴正遭遇著PCR非特異性擴增的尷尬事件。為了解決這個問題，有多少人曾經把退火溫度從50℃試到70℃、重新合成過引物、換過模板、換過全新的電泳緩衝液，或者還帶著滿腔的憤怒捏碎過電泳膠？今天老談來教教大家如何對非特異性擴增嗤之以鼻！
  • 病原微生物基因擴增檢測
    可以將極微量的靶DNA特異性擴增上百萬倍，從而大大提高對DNA分子的分析和檢測能力，能檢測單分子DNA或每10萬個細胞中僅含1個靶DNA分子的樣品，因而此方法在分子生物學、微生物學、醫學及遺傳學等多領域廣泛應用和迅速發展。病原微生物基因擴增檢測不僅能滿足病毒性疾病診斷的需要，還有助於疾病預後的判斷、療效的監測等等。
  • 【分子】目的基因的擴增——PCR原理與過程
    ——PCR引物設計目的基因的擴增——PCR原理與過程聚合酶鏈式反應（PCR）是通過PCR儀，模擬DNA半保留複製，從而體外快速擴增DNA的方式。比如擴基因、檢測、吃螺師粉兒（什麼鬼……）等等。典型的PCR包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三個步驟，通過將這一套過程不斷循環，使DNA得以成百萬倍的擴增。當然這是典型的……不典型的PCR五花八門，等以後用到再跟大家分享( °△ °|||)。因此所謂的PCR儀，其實就是一套自動溫控系統，早先人們做PCR都是用水浴鍋來做，指甲蓋大小的離心管，在三個鍋子裡來回倒來倒去，拼個手速，攢個人品，好不熱鬧。
  • 多重等位基因特異性PCR通用晶片在聽力篩查中的應用
    2.2 寡核苷酸和通用晶片 靠近5』端有15個鹼基的多聚T序列、並且5』-端用氨基標記的探針被共價連接到醛基表面修飾過的玻璃基片（中國北京，博奧生物有限公司，以下簡稱博奧生物）上，用來捕獲等位基因特異性的PCR產物。
  • 第九節 其它鏈擴增技術及應用範圍
    作為標記物的DNA分子可用PCR的擴增，存在特異的PCR產物應證明作為標記物的DNA分子已特異地與抗原-抗體複合物結合，而且表明了抗原的存在。有人採用SAP（streptavidin – protein A）嵌合體作為中介物。它具有雙特異性結合能力，一端為鏈黴親和素，可結合生物素；另一端為可與IgG的Fc段結合的蛋白A。這樣可特異地把生物素化的DNA分子和抗原-抗體複合物連接在一起。
  • PCR擴增分離目的DNA片段
    這項技術已廣泛地應用於分子生物學各個領域，它不僅可用於基因分離克隆和核酸序列分析，還可用於突變體和重組體的構建，基因表達調控的研究，基因多態性的分析，遺傳病和傳染病診斷，腫瘤機制探查，法醫鑑定等方面。PCR技術已成為方法學上的一次革命，它必將大大推動分子生物學各學科的研究發展。
  • 這種做法到最後往往需要重新構建並篩選新的cDNA文庫
    然而，在許多情況下，這種做法的結果常常更令人失望和充滿挫敗感。往往不得不重新構建並篩選新的cDNA文庫。在20世紀80年代後期，Frohman 等(1988)發現一種更好的方法，即用傳統的PCR方法擴增cDNA的5'端序列。
  • PCR專題,引物設計
    DNA序列的保守區是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟體（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區。2.引物長度一般在15~30鹼基之間。
  • 引物合成介紹(5)
    25.用軟體設計的引物為什麼不管用？答：引物是否好用，能否擴增出您需要的引物，與是否用軟體設計沒有太多的關係。引物設計有一定的指導意見，軟體就是根據這些要求設計而成。不要迷信軟體給您設計的引物，軟體中一些參數您可能不明白，弄錯了反而麻煩。其實，PCR擴增的成敗最關鍵的是反應模板的製備和反應條件的控制。
  • RT-PCR引物的選擇
    基因特異性引物   與模板序列互補的引物，適用於目的序列已知的情況。性擴增帶與非特異性擴增帶。引物特異性差重新設計引物，改變引物的位置和長度，增強其特異性或使用巢式
  • PCR及其它核酸擴增技術
    一步法從cDNA合成到PCR擴增的整個反應都在單個試管中進行，通過把逆轉錄酶和DNA聚合酶一次性加入到反應管中，最大程度地減少實驗差異。兩步法需要在單獨的試管中進行逆轉錄酶反應和PCR擴增，儘管增加了反應步驟加大了汙染的可能性，但準確性和靈敏度更高，對RNA模板保護更好。
  • 引物(primers)設計知識介紹
    引物（primers)引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與感興趣區域一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與感興趣區域另一端的另一條DNA模板鏈互補。引物的重要性在整個PCR體系中, 引物佔有十分重要的地位。