總體來講，要確保在實驗中加入所有適當的陰性對照(無RNA、無反轉錄酶、無熱穩定DNA聚合酶)和陽性對照(陽性RNA對照，如果有可能)。
問題(步驟2): 第一鏈cDNA產量少，原因是RNA發生降解。
解決方案：通過變性瓊脂糖凝膠電泳(第2章，方案1)檢測mRNA製備的完整性和濃度。如果RNA降解，要重新製備。
問題(步驟2):第一鏈cDNA產量少。RNA樣本中含有抑制反轉錄酶的成分，如SDS或胍鹽。
解決方案：用乙醇重新沉澱RNA.
問題(步驟2);第一鏈cDNA產量少。當反轉錄反應各組分比例不佳時，PCR過程中會出現假引發擴增。
解決方案：嘗試以下一一種或多種解決方案。
●通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物大小。錯誤的引發擴增通常會導致短cDNA合成，會有彌散條帶在瓊脂糖凝膠中遷移。如果是這一-情況， 要系統優化反轉錄反應的模板引物比例、Mg*濃度和復性溫度。
●改變引物[如將oligo (dT) 換成隨機引物]。
●增加反轉錄反應溫度至42"C或更高。
問題(步驟8):擴增反應低效。
解決方案：可能是第一鏈 cDNA太少。可通過以下方法解決該問題。
●增加擴增反應中cDNA含量。
●通過改變第一鏈cDNA與引物的濃度，使用新dNTP來優化PCR。如果結果仍不滿意，考慮重新設計引物。
●用2U的RNaseH處理第一鏈反應產物(37°C放置20min)，以去除單鏈DNA產物中的RNA模板。