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RT-PCR與qPCR所需要的引物區別
原理不同:螢光定量PCR實時監測與DNA結合的螢光染料激發的螢光;普通pcr通過檢測插入dna中螢光染色劑來看是否有目的片段。 應要求:螢光定量對擴增片段有較高的要求,一般為100-300bp;普通PCR可以擴增長點的片段。螢光定量可以不進行電泳就對產物進行定量分析,普通PCR必須電泳。
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盤點:三代PCR儀原理及應用
Khorana於1971年最早提出核酸體外擴增的設想:經過DNA變性,與合適引物雜交,用DNA聚合酶延伸引物,並不斷重複該過程便可克隆tRNA基因。 但由於測序和引物合成的困難,以及70年代基因工程技術的發明使克隆基因成為可能,所以,Khorana的設想被人們遺忘了。
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德國PCR世家耶拿深度解讀:從哪些方面評價一臺PCR 儀的好壞?
需要能在變性-退火-延伸這三個關鍵步驟進行溫度控制。溫度控制涉及溫度準確性、均一性、升降溫速率、溫度梯度等多個方面。 溫度準確性是PCR儀的重要性能指標。如果儀器溫度準確性差,樣品槽的實際溫度不能達到設定溫度,那就無法獲得預期的擴增結果,即要麼擴增不出來,要麼產生非特異性擴增甚至是錯誤擴增。 溫度均一性是獲得穩定擴增的保障。
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如何設計PCR引物
1、引物長度一般在15-30bp。
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PCR專題,引物設計
2.引物長度一般在15~30鹼基之間。引物長度(primer length)常用的是18-27 bp,但不應大於38,因為過長會導致其延伸溫度大於74℃,不適於Taq DNA 聚合酶進行反應。3.引物GC含量在40%~60%之間,Tm值最好接近72℃。GC含量(composition)過高或過低都不利於引發反應。上下遊引物的GC含量不能相差太大。
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手持式PCR儀?科學家們又有新突破啦!
它通過檢測、分析螢光水平的變化,實現DNA擴增的精準控制。這是來自於範德堡大學的研究團隊最新的研究成果。他們開創性提出一種新方法:「適應性PCR」(adaptive PCR)。PCR反應有5個核心「原料」:DNA模板、引物(一段被設計用於與DNA模板互補的片段)、核苷酸鹼基、DNA聚合酶以及緩衝液。PCR的反應過程包含3個基本步驟,依次為:變性(高溫環境下模板DNA發生變性,由雙鏈變成單鏈)、退火(低溫環境下引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合)、延伸(溫度回升至最適宜後,DNA聚合酶開始合成互補鏈)。至此獲得兩條精確複製地DNA雙鏈。
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PCR由變性、退火、延伸三個基本反應步驟組成
上海皓莊儀器有限公司皓莊(LNB)品牌基因擴增儀PCR儀之PCR技術闡述DNA的半保留複製是生物進化和傳代的重要途徑。因此,通過溫度變化控制DNA的變性和復性,並設計引物做啟動子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外複製。 但是,DNA聚合酶在高溫時會失活,因此,每次循環都得加入新的DNA聚合酶,不僅操作煩瑣,而且價格昂貴,制約了PCR技術的應用和發展。
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重疊延伸PCR簡介
重疊延伸PCR技術(gene splicing by overlap extension PCR,簡稱SOE PCR)由於採用具有互補末端的引物,使PCR產物形成了重疊鏈,從而在隨後的擴增反應中通過重疊鏈的延伸,將不同來源的擴增片段重疊拼接起來.此技術利用PCR技術能夠在體外進行有效的基因重組,而且不需要內切酶消化和連接酶處理,可利用這一技術很快獲得其它依靠限制性內切酶消化的方法難以得到的產物
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我叫極速PCR試劑盒,這是我的說明書
dNTP mixture 30μL 引物
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pcr擴增的原理和步驟
pcr擴增在做實驗的時候是經常用到的,它是基礎實驗,是每個做實驗的人都應該掌握的,下面小編就來說一下PCR擴增的原理和步驟吧。1.pcr擴增的基本原理是PCR技術和DNA的天然複製過程基本是一樣的,其靶序列兩端互補的寡核苷酸引物與其特異性依賴於與DNA的半保留複製。
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設計實時螢光定量PCR引物方法
2.點擊submit後可以看到以下界面,網站會推薦多對引物,可以根據引物長度、Tm值選擇。點擊pick primers後,首先會看到優選推薦的一對引物,同時在序列中看到引物所在位置。Primer3plus網站中可以看到引物Tm值以及GC含量。
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你用的PCR儀,經過校準了嗎?
PCR儀和螢光定量PCR儀是分子生物學實驗室常用儀器。但對於需要達到GLP、ISO 17025、 ISO 13485、ISO/TS 20836這些標準規範的實驗室來說,對儀器設備的校準也是非常重要的。因為儀器用久了,難免會出現偏差或故障,所標示的與實際的對不上。
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RT-PCR引物的選擇
隨機引物 適用於長的或具有發卡結構的RNA 引物連用。引物特異性差重新設計引物,改變引物的位置和長度,增強其特異性或使用巢式PCR引物濃度過高適當減少引物濃度操作多份樣品時,製備反應混合液,先將dNTP、緩衝液、引物和酶混合好,然後分裝,這樣即可以減少操作,避免汙染,又可以增加反應的精確度;5.
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PCR儀的用途機使用方法
產品質量過硬服務優良,公司專業生產各類PCR儀。 PCR的用途及使用方法真核生物的基因組是DNA,為什麼不直接從DNA PCR得到我們需要的基因呢?因為真核生物的基因含有大量的非編碼區,稱為內元(intron),真正編碼蛋白的區段是被這些內元隔開的,這些編碼區叫做外元(exon)。
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PCR技術的原理與方法(2)
能催化以DNA單鏈為模板,以鹼基互補原則為基礎,按5』→3』方向逐個將dNTP分子連接到引物的3』端,合成一條與模板DNA互補的新的DNA子鏈。無3』→5』的外切酶活性,沒有校正功能。某種dNTP或Mg2 濃度過高,會增加其錯配率。用量一般為0.5~5個單位/100μl。
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多重PCR反應中關鍵因素和實驗步驟(2)
引物的選擇遵從簡單的規則:引物長度為 18-24bp 或更長, GC 含量為 35%-60% ,退火溫度 55 ℃ -58 ℃或更高。長些的引物(如 DMD 基因的引物, 28-30bp )使反應在更高的退火溫度下進行並產生較少的非特 異性產物。
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如何校正螢光定量PCR儀
對於許多科研實驗室和工業質控實驗室來說,要達到GLP、ISO 17025、 ISO 13485、ISO/TS 20836規範要求,需要定期對儀器進行校正,包括螢光定量PCR儀。那麼,有沒有一個好的方法對螢光定量PCR儀進行校正呢?有的。
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引物(primers)設計知識介紹
PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結合,不與其他非目的DNA結合,PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能對引物進行有效的延伸,可見引物設計好壞與PCR結果密切相關。引物設計原則1.引物長度 引物長度 一般為15-30個核苷酸,在做長片段PCR或做某些特殊的PCR時應使用較長的引物,但最多不超過50個核苷酸。
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螢光定量PCR實驗(下) 反轉錄和上機檢測