大多數常用的質粒載體中含有多克隆位點，實質上是許多不同的限制性內切核酸酶識別序列的簇。
鑑於目前多克隆位點種類繁多(一些多接頭含有多達46個獨特位點，例如Life Technologies 公司的pSE280; 更長的多接頭也已組裝： Brosius, 1992)， 幾乎總是可以找到一個攜帶獨特的限制性位點的質粒載體，可以與一個特定外源DNA片段的末端兼容。
定向克隆通常需要線性化載體的兩端含有突出末端：①與另一個不一致②與靶DNA的末端一致。然而，在某些情況下，當靶DNA和質粒DNA兩端都攜帶相同的突出末端時，定向克隆也可以實現。
例如，限制性內切核酸酶BamH I和Bgl II識別不同的六核苷酸序列(分別是GGATCC和AGATCT)，生成具有相同3』突出末端的限制性酶切片段。如果攜帶BamHI和BglII末端的DNA片段連接到同樣用這兩種酶切割的載體中，那麼外源DNA可以在任一方向插入。
然而，如果在連接混合物中包含兩種限制性內切核酸酶之一，或者，如果在轉化前使用酶消化連接後的DNA，則只有那些BamHI末端被連接到BglII末端或反之亦然的連接事件，將在大腸桿菌中產生重組產物。
該策略利用的是閉環DNA轉化細菌細胞的頻率比線性DNA高得多的現象。有時候會找不到一個適合的載體、靶DNA、限制性內切核酸酶組合用來定向克隆。此問題的最佳解決方案是用寡核苷酸引物擴增外源DNA片段，引物的兩個末端添加所需的限制性酶切位點(見方案9)。