一文讀懂體外診斷中的核酸提取方法

2020-11-24 騰訊網

前言

體外診斷，即IVD(In Vitro Diagnosis)，是指在人體之外，通過對人體樣本(血液、液、組織等)進行檢測而獲取臨床診斷信息，進而判斷疾病或機體功能的產品和服務。

而檢測人體樣本的關鍵步驟之一，即是樣本中的核酸（DNA和RNA）純化。核酸純化的方法是影響所提取核酸質量的重要因素，只有高質量的核酸才能滿足下遊的各種應用。

目前，常見且適用於所有樣品類型的核酸純化方法有四種。

1

速率區帶離心法

在此法中，密度梯度液頂部的狹窄樣品區帶被分層，從而避免不同沉降速率的顆粒之間交叉汙染問題，（見圖1）。然而，由於上樣區帶狹窄，因此限制了可容納在密度梯度液之上的樣品量（通常為10％）。

圖1. 樣品在密度梯度液之上形成一層狹窄區帶（B）。在離心力作用下，顆粒根據其質量大小以不同的速率移動（C）。

梯度液可以穩定區帶，並且可以增加密度和粘度。當區帶中的顆粒向下移動通過密度介質時，移動速度較快的顆粒就會先於移動較慢的顆粒，從而形成含有類似大小顆粒的各個區帶

此法的缺點是：

離心時間較長；

需要製備惰性梯度介質溶液；

操作嚴格，不易掌握。

2

苯酚- 氯仿萃取

苯酚和氯仿均為有機溶劑，其萃取核酸原理是苯酚與氯仿對於與核酸結合的蛋白質有極強的變性作用，但對核酸本身沒有影響。經離心後，形成上層水相下層酚/氯仿相，變性後的蛋白質溶於酚/氯仿相或者在兩相交界處形成凝膠層，而核酸易溶於水而不溶於有機溶劑從而留在水相；同時，氯仿可以有助於有機相與水相的分離和去除溶於水的部分酚。最後，再將核算通過乙醇沉澱即可達到提取的目的。

此法的缺點是：

蛋白質難以徹底去除；

操作難度大且費時；

使用危險化學品。

3

離心柱純化

此種方法是利用核酸表面會覆蓋一層由水分子構成的薄膜，在高鹽環境下，這層親水膜會遭到破壞從而核酸可被吸附在離心柱上，而其他雜質如蛋白質、代謝產物等則會被離心沉澱與核酸分離。最後通過洗脫，將核酸從吸附膜上脫離，即可得到純化後的核酸。離心柱純化也是的試劑盒提取中廣泛的使用方法。

但即便如此，離心柱純化法仍存在缺點：

高度依賴吸附膜的結合能力；

洗脫不完全導致核酸流失；

無法大量提取核酸。

流程圖

圖2. 離心柱純化法示意圖

4

磁分離法

攜帶正電荷的磁珠易於吸附負電荷的核酸，主要用於從人血清或血漿樣品中提取DNA 和RNA（例如從血液樣本中檢測HIV 或HBV 病毒基因組的樣品製備）。一般而言，將樣品與結合緩衝液和磁珠混合，核酸與磁珠結合後，經過數次洗滌與磁場捕獲，洗脫下來的核酸即可通過PCR 或其它特定方法來檢測特定的DNA 或RNA。磁分離法也是廣泛應用於診斷行業，且能實現高通量、自動化的核酸提取方法。

圖3. 磁珠核酸提取流程示意圖

相較於實驗研究中單一且可控的環境，實際應用上在核酸提取上除了技術壁壘之外還會面臨樣品量有限、樣品遭到汙染等挑戰。因此，各大公司正致力於開發更加全面的解決方案，以提高核酸純化的通量。

純化好幫手——MagPrepSilica 磁顆粒

圖4. 電鏡照片下MagPrep 矽粒子的粒徑和晶體結構

Sigma-Aldrich（現默克生命科學下屬的子品牌，以下簡稱sigma）MagPrepSilica 磁顆粒（如圖4 所示）正為滿足這一需求而開發，MagPrepSilica 磁顆粒是由表面包裹著一層矽的磁鐵礦組成，而非市面上常見的磁性微球。這些懸浮在緩衝液（50mM MES, pH 5.5）中的黑色顆粒平均粒徑為100nm( 通常為50–200nm)。小粒徑的磁顆粒擁有更大的表面積，這對能否從大量樣本中成功提取微量的目的分子至關重要。此外，粒徑小的磁顆粒可保持幾分鐘的懸浮狀態，這也為目的分子的結合提供了充裕的時間。由於磁含量高達95%，磁顆粒很容易在磁場中迅速分離。通常情況下, 磁場捕獲反應在2 分鐘內即可完成。磁分離技術讓各大實驗室能夠在一天時間內實現成千上萬的核酸樣本自動化純化。此外，該技術在檢測諸如細胞粗提取物或類似食品粗勻漿物等複雜樣品時也極具優勢。

除卻核酸，MagPrep Silica還可以

吸附細菌

吸附病毒

吸附白細胞

分離血液中的全DNA

分離細菌中的全DNA

分離病毒DNA/RNA

純化PCR 片段

去除測序反應中的染料

分離質粒DNA

並且MagPrep Silica可從多種樣本中提取目的物質，如：

能從全血中吸附白細胞

能從生長基質中吸附細菌

能從血漿中吸附病毒

能在高離液和酸性條件下吸附核酸

可使用水性或含乙醇的緩衝液洗滌

MagPrep Silica 磁顆粒產品類型

我們可提供3 種MagPrepSilica 磁顆粒：「LS」（基礎型），「MS」型和「HS」型。「LS」型吸附RNA效果好，在特定條件下，也能吸附DNA。「HS」型選擇性吸附DNA。「MS」型可同時吸附DNA 和RNA。用戶可根據核酸純化過程中的結合、洗滌條件以及樣本類型的不同選擇最佳搭配。

*可根據客戶要求提供更大的包裝規格

來源：默克生命科學

編輯：As素 | 校對：三水 | 責編：Weber

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