器審中心 | 一文讀懂新型冠狀病毒的核酸檢測!

2019年12月以來，武漢市部分醫療機構陸續出現不明原因肺炎病例。國家藥品監督管理局隨即啟動《醫療器械應急審批程序》。目前，已批准7家企業的新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒上市。為進一步合理使用上述產品，有效滿足疫情防控需求，現將使用情況做如下說明：

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新型冠狀病毒的核酸檢測原理

所有生物除朊病毒外都含有核酸，核酸包括脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），新型冠狀病毒是一種僅含有RNA的病毒，病毒中特異性RNA序列是區分該病毒與其它病原體的標誌物。新型冠狀病毒出現後，我國科學家在極短的時間裡完成了對新型冠狀病毒全基因組序列的解析，並通過與其它物種的基因組序列對比，發現了新型冠狀病毒中的特異核酸序列。臨床實驗室檢測過程中，如果能在患者樣本中檢測到新型冠狀病毒的特異核酸序列，應提示該患者可能被新型冠狀病毒感染。

檢測新型冠狀病毒特異序列的方法最常見的是螢光定量PCR（聚合酶鏈式反應）。因PCR反應模板僅為DNA，因此在進行PCR反應前，應將新型冠狀病毒核酸（RNA）逆轉錄為DNA。在PCR反應體系中，包含一對特異性引物以及一個Taqman探針，該探針為一段特異性寡核苷酸序列，兩端分別標記了報告螢光基團和淬滅螢光基團。探針完整時，報告基團發射的螢光信號被淬滅基團吸收；如反應體系存在靶序列，PCR反應時探針與模板結合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針酶切降解，報告基團與淬滅基團分離，發出螢光。每擴增一條DNA鏈，就有一個螢光分子產生。螢光定量PCR儀能夠監測出螢光到達預先設定閾值的循環數（Ct值）與病毒核酸濃度有關，病毒核酸濃度越高， Ct值越小。不同生產企業的產品會依據自身產品的性能確定本產品的陽性判斷值。

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新型冠狀病毒的核酸檢測流程

對於新型冠狀病毒的核酸檢測，首先根據試劑盒說明書【樣本要求】部分進行樣本採集，常規的樣本類型包括咽拭子、鼻拭子、痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液等。由於新型冠狀病毒為RNA病毒，RNA易降解，因此，採集樣本時使用無RNA酶的拭子和無RNA酶的儲存管。獲得患者樣本後，需儘快進行檢測，如無法立即檢測需要轉運的樣本，應按照說明書的要求進行低溫封裝，並送到專門的檢測機構進行檢測。檢測機構收到樣本後，對樣本進行核酸提取，核酸提取試劑應使用批准產品說明書中指定的核酸提取試劑盒。

（圖：咽拭子取樣示意圖）

病毒RNA需要首先逆轉錄為cDNA，再進行擴增檢測。PCR擴增和檢測應使用批准產品說明書中指定的螢光定量PCR儀，通過螢光定量PCR所得到的樣本Ct值的大小，可以判斷患者樣本中是否含有新型冠狀病毒。

上述過程中樣本的採集、保存、轉運，樣本核酸的提取和檢測、結果的判讀均須嚴格按照試劑盒說明書要求進行。欲直觀了解具體的檢測過程，可查詢相關示範視頻，例如北京協和醫院錄製的示範短片。（各企業的提取處理等過程不盡相同，該視頻僅為舉例，具體操作應參照產品說明書）

（視頻來源：北京協和醫院）

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使用新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒的注意事項

（一）全流程的質量控制

在新型冠狀病毒的檢測過程中，三個最為關鍵的要素是人員，實驗室和試劑盒。

首先，核酸檢測的整個檢測流程操作複雜，不同產品因存在不同反應體系及適用機型等因素，操作過程中試驗人員應按照各自產品說明書要求進行。

實驗室檢測往往從樣本提取開始，但實際上，要保證樣本的檢測準確，應從患者樣本的採集開始進行質量控制，並對後續各個流程規範操作（如樣本的保存、轉運等）。有研究表明，不同人員對同一患者的樣本進行採集，可能存在不同的檢測結果。試劑在保存、運輸及使用過程中操作不當均可能影響其檢測結果。因此，需要嚴格按照說明書的規定操作。

其次，新型冠狀病毒傳播能力強，危險係數高，個人防護應為生物安全三級實驗室級別。每個操作人員必須具備專業技能且擁有PCR檢驗資質。整個操作過程中需防範氣溶膠汙染對人員的感染風險，並做到準確加樣和正確使用試劑和耗材。

最後，為防止病毒擴散，檢測新型冠狀病毒的實驗室必須達到生物安全二級（P2）及以上實驗室條件，實驗室管理應嚴格按照PCR基因擴增實驗室的管理規範，實驗操作必須嚴格分區，各區域使用的儀器、設備、耗材和工作服必須專用，不得交叉使用，避免汙染。

所有檢測樣本應視為具有傳染性物質，實驗過程中穿工作服，戴一次性手套並經常替換手套以避免樣本間的交叉汙染；樣本操作、廢棄物處理均需符合衛生部《微生物生物醫學實驗室生物安全通用準則》和《醫療廢物管理條例》等相關法規要求。

（二）檢測結果判斷要求

目前批准產品均基於新型冠狀病毒基因組中開放讀碼框1a/b（open reading frame 1ab，ORF1ab）、包膜蛋白（Envelope protein，E）和核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）進行選擇。不同產品的檢測原理基本一致，但是其引物、探針設計存在不同，有單靶區段（ORF1ab）、雙靶區段（ORF1ab、N蛋白）、三靶區段（ORF1ab、N蛋白和E蛋白）的檢測和判讀差別。建議使用者應嚴格按照不同企業說明書規定的判讀方式進行判讀。

依據《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版）》確診病例要求，臨床診斷病例或疑似病例，具備以下病原學證據之一者：1.呼吸道標本或血液標本實時螢光RT-PCR檢測新型冠狀病毒核酸為陽性；2.呼吸道標本或血液標本病毒基因測序，與已知的新型冠狀病毒高度同源。

如臨床人員對檢測結果感覺明顯不符。建議對整個檢測環節（如：對樣本的採集、轉動及處理等環節）進行分析。應關注檢測結果為陰性的患者，不排除新型冠狀病毒早期感染或其他呼吸道病毒感染等。如條件允許，建議採集痰液或肺泡灌洗液等敏感性更高的樣本進行複測。