高表達抗體蛋白下遊工藝技術進展

　　隨著抗體藥物上遊大規模高效培養技術的飛速發展，抗體蛋白的表達濃度有了大幅度的提高，這給下遊純化工藝帶來了巨大的壓力。為了突破下遊技術瓶頸，整個世界生物製藥產業都加大了對下遊技術的革新力度，近年來也取得了豐碩的成果。本文就抗體藥物的純化策略、最新技術進展以及技術應用等方面做一個調研，以期能對本部門的相關研究工作有所助益。

　　自1997年來，全球抗體藥物市場經歷了一個快速發展的階段，總銷售額從1997年的3.1億美元增長到2008年的400億美元，複合增長率高達55%，而且增長勢頭還在持續 [1]。國際上通常把年銷售額超過10 億美元的品牌藥稱為「重磅炸彈」藥物，很大一部分抗體藥物都已邁入「重磅炸彈」行列。在2008年全球15大藥品中，抗體藥物佔據了1/3，且排名仍在上升，這意味著幾乎每種單抗藥物的成功開發都代表著巨大的市場前景[2]。受益於此，全球主要的生物製藥公司都獲利頗豐，可見抗體藥物具有巨大的經濟價值和社會價值。

　　抗體藥物生產技術門檻高，需要掌握抗體篩選、抗體重組、高表達細胞株構建和大規模懸浮培養等核心技術，其下遊關鍵技術是長期以來的薄弱之處。哺乳動物細胞表達系統具有活性高、穩定性好等優點，已成為抗體等生物製品最重要的系統之一，為抗體藥物的產業化提供可能。目前，國際上該項技術發展較快，已趨成熟，以默克公司為代表的流加培養生產規模達10000L以上，以貝爾公司為代表的灌流培養生產規模達200L以上，蛋白表達濃度為1-10g/L。我國在該技術領域起步較晚，基礎較差，但近年來經過努力，已經實現了該項技術的突破，流加培養規模達500L以上，灌流培養規模達100L以上，蛋白表達濃度為0.2-2g/L[2]。

　　隨著動物細胞表達抗體產品大規模高效培養技術的快速發展，下遊純化工藝越來越成為抗體藥物生產中主要的技術瓶頸[3]。因此，如何提高下遊工藝的生產效率就成為了抗體藥物研發必須解決的問題。本文就國際上高表達抗體蛋白下遊工藝的研究進展做一個調研，使本人及同事們能了解國際上的研究成果和發展趨勢，以期能對本部門的相關研究工作有所助益。

　　1. 抗體藥物純化策略

　　每個單抗的等電點、電荷密度、疏水性、糖基化程度等生化性質各不相同。選擇單抗的純化方法，既要了解它們的共性，又要了解它們的個性，從而制定相應的純化策略(表1)。

　　1.1 抗體藥物下遊工藝一般策略

　　CHO和NSO等哺乳動物細胞表達系統主要用來生產治療性單抗，臨床劑量大(數十至幾百毫克/dose)，批產量達公斤級，純度要求極高。層析技術是抗體分離純化的核心技術，一般採用經典的三步純化策略：粗純-中間純化-精細純化。粗純的主要目的是捕獲、濃縮和穩定樣品，約80%的下遊工藝用Protein A親和層析進行快速捕獲，一步即可達到95%以上的純度。治療用抗體一般使用動物細胞大規模高密度無血清懸浮培養進行生產，不僅對終產品的單體含量有嚴格的規定，還必須去除各種潛在的雜質以滿足藥品安全的要求，因此在粗純之後還需要進行中間純化和精細純化，去除宿主細胞蛋白(HCP)、宿主DNA、抗體聚集體和變體等，常用的層析技術有離子交換、凝膠過濾、疏水層析等[4]。

　　2003 年初，中國SFDA下屬的中國藥品與生物製品檢定所(NICPBP)公布了《人用單克隆抗體質量控制技術指導原則》[5]。生產者除須保證最終抗體產品純度，還需要驗證所用的純化方法能有效對潛在的汙染物，如HCP、免疫球蛋白、宿主DNA、用於生產腹水抗體的刺激物、內毒素、培養液成分、層析凝膠析出成分(脫落的Protein A配基)進行去除;並能有效的去除/滅活病毒。也就是說，在設計下遊工藝時，需多角度綜合考慮抗體本身的性質、抗體的來源、發酵培養技術、發酵液蛋白濃度、宿主雜質、抗體批間的差異、潛在汙染及病毒滅活等問題。此外，治療用抗體在生產和純化過程中還會由於糖基化程度不同、蛋白酶作用、以及脫氨基和脫醯胺等反應而產生帶電性質不同的多種抗體變體;另外，抗體氧化、聚集和片段化也是常見的降解途徑[4]。針對這些變體，一方面，在表達和純化過程中選擇參數(如pH、鹽濃度等)時要充分考慮到目標抗體的穩定性;另一方面，應控制細胞培養的條件(DO、滲透壓等)，同時加快下遊分離純化的速度，最大程度上避免抗體在純化過程中產生變體，從而保證終產品的均一性和高的比活，也有利於控制終產品的內毒素水平。

表1 單抗特性及純化策略

　　1.2 新型的兩步層析技術與純化工藝整合

　　近年來，GE Healthcare公司開發出了新型的親和捕獲介質Mabselect SuRe和混合作用模式的強陰離子交換介質Capto adhere(這兩種介質的主要特點將在下文詳細介紹)。憑藉著MabSelect SuRe的卓越性能以及Capto adhere的複合多除雜功能，使得抗體純化工藝由經典的三步層析轉變為兩步層析得以實現。這種新型的兩步層析技術的工藝流程是：在細胞培養表達以後，採用0.2-0.45μm的中空纖維膜技術進行澄清，然後用MabSelect SuRe捕獲，酸性條件洗脫後直接pH 4.0病毒滅活，澄清過濾後穿透方式上Capto adhere，這一步離子交換之前或之後會有一步20nm納濾去病毒，最後50K膜超濾濃縮和洗濾進行緩衝液置換。整個工藝如圖1,這一工藝平臺已經嘗試過多個不同的抗體並取得成功(表2),同時很多實驗表明這一工藝平臺適合多數抗體的生產。有些抗體如果通過優化結果不甚滿意, 通過增加一步Capto Q也基本上可以達到要求或是採用Capto S-Capto Q(這兩種介質的主要特點將在下文詳細介紹)的工藝步驟[4]。

　　

圖1　抗體生產兩步層析法主導的抗體純化最新工藝[6]

　　Mabselect SuRe可以達到99%以上的抗體純度，親和洗脫峰使用Capto adhere的流穿模式進行精純：使抗體分子流穿而聚合體、HCP、脫落的Protein A配基等雜質結合在柱上加以去除。這樣僅用兩步層析就可以得到符合藥用級質量要求的高純度抗體產品，大大縮短了工藝時間，提高了生產效率，同時增加了收率，降低了生產成本。

表2 兩步法用於多種抗體的純化結果(括號內數值為純化前)[4]

　　2. 抗體藥物下遊技術最新研究進展

　　2.1 樣品澄清

　　2.1.1 中空纖維膜過濾技術

　　中空纖維膜是近年來發展起來的新型切向流膜分離技術,與盒式膜包相比,中空纖維膜可以直接處理高固含量和高黏度的粗料液,具有容塵量高、速度快、剪切力小、成本低等優點。目前,中空纖維微濾膜已經廣泛用於生物製藥的各個領域[7]。

　　對於動物細胞培養液,可以將高密度的培養液直接用中空纖維微濾膜(0.22或0.45μm)進行澄清,而無需事先經過離心和預過濾,步驟少,速度快,收率高,成本低。和離心機比較,具有極高的澄清度,因此中空纖維澄清後的細胞培養液可直接Protein A親和層析進行純化。

　　中空纖維膜澄清細胞培養液的優勢有：(1)步驟少,速度快,收率更高(通過有效的洗濾可使樣品收率穩定而且高於離心機)，同時最大程度上避免抗體降解而影響產品均一性。(2)成本低：不僅省去了連續流高速離心機昂貴的前期投資和運轉的日常維護成本，還節省了離心後死端過濾的成本。中空纖維膜物理化學性質穩定，可以通過清洗而反覆使用，成本低廉。(3)有利於內毒素控制：中空纖維膜穩定的化學性質可以耐受1M NaOH 40-50℃和氧化劑NaClO的清洗，從而有效去除內毒素;封閉的系統，也更有利於生產過程中內毒素的控制。此外，大部分中空纖維濾柱還可以進行高壓滅菌。(4)低剪切力：中空纖維採用低剪切力的開放式流道，不僅可以處理含有高固含量的料液，還避免了蛋白質活性分子在高剪切力下的聚集變性，有利於抗體的穩定。(5)工藝耐用性強：相比死端過濾，中空纖維澄清具有很好的操作靈活性和耐用性，可以通過調整操作參數(流速、TMP)處理不同性質的細胞培養液。(6)易於線性放大：通過維持切向流速、TMP 等參數恆定，方便地進行線性放大，生產規模的處理量可達幾千升料液，目前國內銷售最大的中空纖維膜過濾系統已達400m2且生產穩定[8]。

　　2.1.2 深層過濾介質

　　深層過濾採用兩種機制去除顆粒。首先是攔截，顆粒由於自身的物理尺寸在過濾器內被截留。它們可能被困在過濾器表面，因此根本沒有進入基質，或在通過深層過濾基質的曲徑時被俘獲(篩選)。顆粒攔截伴隨過濾器壓差增高，因為它的基質被不斷累積的顆粒堵塞。第二種機制是吸附，比過濾器攔截精度更小的顆粒能夠從流體中被吸附去除。這種機制是通過深層過濾基質上的淨電荷實現的[26]。

　　目前應用比較廣泛的雙層膜深層過濾介質有Millipore公司的Millistak+HC、Sartorius公司的Sartobran-P、Pall公司的Supradisc HP等。Millistak+HC深層過濾介質由纖維素和無機助濾劑(聚丙稀粘合的硅藻土)組成，包裹在聚丙烯外殼內;它由兩層全厚度深層濾板(上遊一層粗過濾和下遊一層精細過濾)組成，附帶一層RW01纖維素膜終過濾。Sartobran-P深層過濾介質由醋酸纖維素濾膜、聚丙烯外殼和支撐層組成，加強型的濾膜有良好的機械強度，有利於在反覆的過濾和滅菌過程中保持完好無損;採用了摺疊膜，在體積小巧的同時還保證了超大的過濾面積。Supradisc HP深層過濾介質由纖維素、硅藻土、帶正電荷樹脂和聚丙烯組成;也由兩層全厚度深層濾板(上遊一層粗過濾和下遊一層精細過濾)組成。

　　2.2最新抗體捕獲技術

　　2.2.1 MabSelect介質

　　MabSelect是第一個使用高流速瓊脂糖凝膠作為骨架的新型Protein A層析介質，專為大規模抗體純化而設計，適合快速高效的進行抗體生產和放大，已經成為單抗純化和放大的標準介質。

　　MabSelect的特點有：(1)更高的流速和動態載量：Protein A經基因工程改造，C端含一個半胱氨酸，形成一個定向的硫酯鍵，同時增加了對IgG的有效結合。Protein A和凝膠偶聯時採用了全新的單點偶聯工藝，降低了空間位阻，因此可以在使用更高流速的條件下增加動態載量：在線形流速為500cm/hr和柱床高度為20cm(停留時間2.4min)的條件下，每毫升MabSelect的動態載量可以達到>30mg IgG。(2)更低的非特異性吸附，抗體純度更高：Mabselect介質高度親水性的瓊脂糖骨架最大程度上降低了非特異性吸附，使得洗脫峰中雜蛋白和DNA更少，有利於後期抗體的精細純化。著名的抗體生產商IDEC公司以及R.Hahn的研究顯示，Mabselect對CHO細胞HCP的吸附比其它Protein A介質低7倍[9-10]。R.L.Fahrner等的研究顯示，Mabselect所得抗體的DNA殘留量比其它Protein A介質低30%[11]。(3)更低的Protein A脫落：MabSelect由於通過新型環氧共價交聯技術，Protein A的脫落比其它同類介質低，這不僅有利於抗體純化，還延長了介質的使用壽命，降低了生產成本。(4)更易於工藝的線性放大：通過實驗室條件的優化，MabSelect 可以在保持線性流速和上樣比例等參數不變的條件下，通過增加柱直徑進行線性放大。(5)MabSelect 易於清洗與除菌，壽命更長、更經濟：在長期連續的生產中，有效的在位清洗(CIP)有助於延長介質使用壽命，但一般的Protein A介質往往不能耐受NaOH，只能使用高濃度的尿素或鹽酸胍進行清洗，效果遠不如NaOH且成本非常高。而MabSelect的CIP和除菌程序簡單，用很常規、經濟的試劑如50mM NaOH+1M NaCl或50mM NaOH+0.5M Na2SO4就可以有效去除沉澱和變性物質;用非離子去汙劑或酒精可以去除通過疏水作用結合的物質;用0.1M醋酸和20%酒精可以在位滅菌(SIP)。經測試，Mabselect配合CIP(50mMNaOH+1M NaCl)純化三百次後，抗體產品純度與收率不變[12]。

　　2.2.2 MabSelect Xtra介質

　　Mabselect Xtra介質是在Mabselect介質的基礎上優化而來，是目前市場上所有的商品化Protein A介質中載量最高的親和層析介質之一。它除了具有MabSelect介質的全部特點外，還具有載量最高和非特異性吸附更低的特點。

　　Mabselect Xtra介質使用孔徑更大的多孔高流速瓊脂糖作為骨架，同時減小介質粒徑。這樣不僅增加了比表面積和配基密度，還降低了傳質阻力，從而有效的增加了動態載量。其動態載量超過41mg/ml，在工藝生產過程中可以有效減少層析柱的體積，從而降低生產成本。R.Hahn的研究顯示，Mabselect Xtra對CHO細胞HCP的吸附比其它Protein A介質更是低了近10倍[13]。

　　2.2.3 MabSelect SuRe介質

　　MabSelect SuRe介質也是在Mabselect介質的基礎上優化而來，是目前市場上唯一耐強鹼的Protein A親和層析介質，壽命最長，穩定性最好[10]。它除了具有MabSelect介質的全部特點外，還具有以下特點：(1)可以耐受0.1-0.5M NaOH：MabSelectSuRe具有不同於其它Protein A介質的同型四聚體配基-SuRe配基，即使在強鹼條件下也不易變性或脫落，可以用高達0.5M NaOH進行CIP和SIP，能有效去除沉澱和變性物質，大大降低了抗體產品被內毒素汙染和批間交叉汙染的風險，有利於延長介質使用壽命，同時還大大降低了CIP和SIP的成本。(2)更溫和的洗脫，避免抗體聚集，提高收率：同型四聚體配基避免了不同配基與抗體Fc段親和性的差異，也消除了某些域對Fab段的親和作用，使得洗脫條件更加均一而溫和。Mabselect SuRe介質可以用更高的pH進行洗脫，有效避免了抗體在低pH下的聚集，產品純度和均一性更高，濁度也更低[14]。(3)不同抗體洗脫所需pH差異小：由於消除了對抗體Fab段的親和作用，使得同一種屬亞型的不同抗體分子洗脫所需的條件更接近，有利於平臺技術的建立，進一步降低了不同的抗體分離純化工藝的研發成本。(4)SuRe 配基穩定性更好：SuRe配基對鹼和蛋白酶更穩定，純化過程中脫落更少(<10ppm)，有利於後期脫落配基的進一步去除。

　　2.2.4 ProSep-vA Ultra介質

　　ProSep-vA Ultra介質是將自然界非動物性來源的Protein A交聯於700?的多孔性玻璃珠骨架上，是剛性和不可壓縮的介質。ProSep-vA Ultra介質具有如下特點：低反壓性;不收縮、不溶脹;高動態載量;極低的Protein A脫落;高重複使用性，標準化的清洗和除菌操作[27]。

　　2.2.5 ProSep Ultra Plus介質

　　ProSep Ultra Plus介質是在ProSep-vA Ultra介質基礎上優化而來，也是目前市場上所有的商品化Protein A介質中載量最高的親和層析介質之一。它除了具有ProSep-vA Ultra介質的全部特點外，還具有載量最高、純化效率更高、工藝更易於放大、成本更低等特點[28]。

　　2.2.6 MEP Hypercel介質

　　MEP Hypercel複合作用模式介質是一種靈活的層析介質設計，也稱之為疏水電荷誘導層析(HCIC)，用於捕獲和純化從實驗室到生產規模的抗體和各種重組蛋白。MEP Hypercel介質由一個獨特的連接4-巰基乙基吡啶(4-MEP)的剛性纖維素骨架組成。纖維素骨架賦予高孔隙率、化學穩定性和低非特異性吸附。平均直徑80-100μm，在低反壓下有優良的流速特性。MEP Hypercel介質在大規模使用時具有顯著優勢，基於它的配基結構，可選擇性地捕獲免疫球蛋白。組合其它傳統的方法如離子交換、疏水作用，甚至用在Protein A之後從不同的料液中直接捕獲或中度純化抗體，以增強對宿主DNA、HCP和聚合體的清除。MEP Hypercel介質有助於建立一個簡化的工藝流程，節省操作步驟(例如洗濾、超濾等);預計有更長的使用壽命，因為它可以耐受苛刻的CIP方法(0.5-1M NaOH，30-60分鐘接觸時間)，而所有因素都有利於降低成本[29]。

　　2.3最新精細純化技術

　　2.3.1 CaptoFamily系列介質

　　新型的Capto S，Q系列介質是以高流速瓊脂糖為骨架，同時交聯了非常「柔軟」的葡聚糖鏈，這樣不僅增加了比表面積，同時降低了傳質阻力和空間位阻，使得介質在高流速下的動態載量大大增加，有利於提高生產效率，降低成本。

　　Capto S，Q系列介質可以裝填在直徑60cm的工業層析柱中使用高達500cm/h 的流速進行純化(柱高30cm)。這樣不僅有利於工藝放大後大規模層析柱的填裝，還大大提高了生產效率，每步層析更短的操作時間也有效避免了抗體分子在分離純化過程中產生各種變體和聚合體，使得收率更好，終產品的活性更高、性質更均一。

　　2.3.2 Captoadhere介質

　　為了進一步減少抗體分離純化步驟，提高特定雜質的去除效率，以滿足日益增長的治療用抗體的生產需要，2007 年初，GE Healthcare公司推出了新型複合作用模式的強陰離子交換介質：Capto adhere介質。Capto adher介質專為治療用抗體的分離純化而設計，其配基綜合了陰離子交換、氫鍵和疏水等多種複雜的作用方式，因此對於抗體的聚合體具有非常獨特而高效的去除能力。此外，通過有效的實驗設計(DoE)，流穿模式的Capto adher介質還可以同時有效去除脫落的Protein A配基、HCP、宿主DNA、內毒素和潛在的病毒，並使得結合MabSelect SuRe的抗體兩步層析純化工藝成為現實(表3)。Capto adhere還具有很強的病毒去除能力，如MVM病毒的去除能力可達5.9個Log。目前，新型的兩步法抗體層析純化工藝已經被國內外諸多知名藥企廣泛用於多種抗體的分離純化，各項指標均符合治療用抗體的要求。Capto adher層析還可以和陰離子交換(Capto Q)和疏水層析等結合使用，以達到更高的質量要求[15]。

表3 兩步層析純化工藝對汙染物的去除效果[15]

　　2.3.3膜層析技術

　　PALL Life Science公司自10餘年前顛覆性地開發出獨一無二的層析產品-Mustang膜層析系列產品後，經過不斷地技術改造，於近年推出全新Mustang Q XT家族，擴展了膜層析工藝放大產品線。膜層析技術，相對於傳統的柱層析，無需層析填料和層析柱等複雜構件，直接通過膜式過濾器，經過簡單的過濾環節即可達到純化目的。Mustang Q以16層超級打褶的聚醚碸過濾膜作為基架，上面偶聯了季胺基等功能基團，可以使生物分子流經的時候與功能位點迅速結合，具有高流速和高動態載量等優點。

　　Sartorius Stedim公司也開發出了一整套膜層析技術，包括Sartobind S,Q,C和D離子交換、Sartobind IDA(亞氨基二乙酸)金屬螯合、Sartobind醛、Sartobind環氧基和Sartobind Protein A(重組)等膜層析系列產品。Sartobind在很多蛋白和病毒純化應用中可以取代傳統耗時、繁瑣的層析步驟。膜吸附器的快速純化特點使蛋白分離可以在高流速下獲得高收率，較傳統柱層析流速最高能提高100倍，達到20-40 CV/min。傳統顆粒膠95%以上的結合位點集中在顆粒膠內部。Sartobind膜層析的結合位點是均一地交聯到交叉偶聯的增強纖維素骨架內0.5-1μm厚的薄層上。大孔結構和快速吸附結合特性使膜吸附器可以忽略擴散時間因素。同時多微孔膜結構不存在傳統顆粒膠的孔內擴散問題。在對流情況下，流動相的分子運動只由泵壓力決定。因此，膜吸附器具有操作周期極短、流速和處理能力極高的特點[30]。

　　與離子交換柱層析相比，離子交換膜層析技術已經被證明利用高動態結合能力吸附大量的生物分子，如病毒、HCP和宿主DNA。最近，陰離子交換膜層析技術已經被作為柱層析技術的替代技術用於Protein A親和捕獲後的mAb中微量汙染物的去除[16]。

　　2.4終產品的濃縮洗濾

　　多維純化得到的洗脫峰可以用Kvick Lab/Process盒式膜包進行快速濃縮和緩衝液置換。Kvick盒式膜包的優點有：(1)無熱原：很多時候，僅用0.5M NaOH 清洗難以徹底去除膜表面的熱原。Kvick盒式膜包化學性質非常穩定，可以使用1M NaOH在40-50℃下進行徹底的SIP/CIP，避免最終超濾濃縮時引入熱原而影響產品質量。(2)孔徑均一、速度快：Kvick盒式膜包孔徑更均一，甚至可以使用50-100K的膜包進行抗體濃縮而不漏過，速度更快，大大節省了操作時間。(3)易於線性放大：通過保持流速、TMP等參數恆定，可以直接線性放大到生產規模。

　　Amicon Ultra系列超濾離心管可以用來進行抗體的快速濃縮、脫鹽及緩衝液置換。它具有如下特點：(1)效率高：一步法離心達到25到80倍濃縮。(2)節省時間：垂直結構的膜，避免堵膜，減少濃差極化，可以用超快離心速度極短時間完成;最少10分鐘即可完成濃縮、脫鹽或緩衝液置換。(3)收率高：獨特的反轉離心設計，有利於取得最大回收率且避免了人為移液誤差;低吸附濾膜和聚丙烯內殼，使回收率高達90%以上。(4)不漏液、無損失：100%完整性測試確保不漏液;獨特的死體積設計避免過度離心至幹，沒有樣品損失。(5)廣泛的化學相容性：與廣泛的溶劑兼容，適用於pH1-pH9，熱封膜杜絕了粘合劑和下遊溶出物汙染。

　　Vivaspin系列超濾離心管同樣是進行蛋白質快速濃縮和緩衝液置換的常用產品。獲得專利的垂直膜配合狹長的流道設計，有效地避免濾膜堵塞，提高濃縮速度;同時在濃縮管底部設計有死端結構，確保即使離心時間過長也不會發生樣品被甩幹的現象。Vivaspin可靈活選用三種不同材質的超濾膜：聚醚碸、三醋酸纖維和Hydrosart。它的另一個特點是有兩種回收濃縮液的方法，既可以直接用移液器從濃縮管底部吸取，也可以將濃縮液反轉離心到回收管內，加蓋密封保存，這兩種方法都保證了高回收率。Vivaspin經過一次離心，最高可以將蛋白溶液濃縮300倍。

　　2.5終產品的除菌除病毒過濾

　　濃縮後的樣品，最終經過0.22μm無菌濾器進行除菌過濾。ULTA Pure SG，HC除菌濾器具有過濾速度快、化學穩定性好、載量高和溶出物少等優點，細菌挑戰實驗表明其除菌能力大於7log。除菌過濾過程的優化主要從三個方面入手：操作過程中過膜壓力的控制、過膜流速以及單位膜載量控制，這三個參數優化以後，可以在同種類型、材質的NFF膜上進行線性放大，否則很容易影響收率。

　　Durapore除菌級親水性濾膜由親水性PVDF材料製造，具有可靠的除菌保證以及低蛋白吸附量、低析出、無纖維脫落、廣泛的化學兼容性等優點，是常用的除菌濾膜。Durapore 0.22μm親水性濾膜用於液體除菌或去除微粒，0.1μm親水性濾膜用於液體中去除微粒、微生物和支原體。裝有Durapore親水性濾膜的濾器有Millipak、Opticap XL、Opticap XLT、筒式濾器和Optiscale等。Millipak濾器獨特的堆疊盤狀設計使殘留量最小並且無顆粒脫落，因此適合於高附加值產品的終端過濾和灌裝。Millipak和Opticap XL濾器都有O型圈墊片和軟管倒鉤連接的上遊排氣閥和排空閥設計，使操作簡單易控。Opticap XL和XLT濾器的結構設計，特別耐高溫、高壓條件，在除菌過程中提供更高的穩定性和可靠性，同時更易清洗。Optiscale一次性濾器專為小規模工藝篩選和工藝放大所設計，是工藝評估的理想工具。

　　目前被廣泛應用的生物製品病毒去除的方法是納米膜過濾。納米膜過濾有如下優點：(1)針對性強，實用性廣：納米膜過濾只與病毒和目的蛋白的大小有關，無論病毒是否有脂包膜外殼、是否耐熱，納米膜過濾都能將之去除。(2)毒性小，下遊汙染少：能有效去除殺滅病毒後可能留下的如抗原和核酸蛋白混合物等病毒標誌物，有效降低下遊汙染，是納米膜的另一特點。大多數病毒滅活處理都使用有毒或致突變的理化試劑，從而必須在使用後從蛋白質溶液中清除，而納米膜過濾不存在毒性問題，只是在驗證中要考慮到濾器浸出物的風險。(3)蛋白活性高，回收率高：納米膜過濾是在正常條件下的pH、滲透壓和溫度下進行的溫和的生產步驟，其蛋白回收率和活性都很高，通常在90%—95%。基於體外分析、實驗研究和臨床經驗，納米膜過濾試驗都沒有顯示出蛋白質改變或是新抗原的產生。納米膜過濾不改變製品特性，這一特點促進了監管機構認可和產品的註冊。

　　日本Asahi Kasei公司於1989年推出了第一款專門為清除生物製藥產品中病毒顆粒而設計的過濾器Planova，由親水銅銨再生纖維素製成的中空纖維微孔膜，裝入聚碳酸酯殼體中。Millipore公司的Viresolve NFP膜是一種複合PVDF膜，過濾盒被設計來從高純蛋白溶液中移除小型病毒，如B19，蛋白質溶液中，B19的去除量通常>4 log。PALL Life Science公司的Ultipor VF DV50和DV20膜式過濾器可以從生物流體中去除顯著數量級的病毒，同時目標蛋白可以很好地通過。濾芯由三層獨特的親水、低蛋白吸附的PVDF濾膜經新月型打褶方式構成，過濾面積大，具有可靠、安全和高流量等特點。Sartorius Stedim生產的Virosart CPV為聚醚碸過濾器，能去除>4 log的PPV和>6 log的逆轉錄病毒。

　　2.5擴張柱床吸附層析技術

　　擴張柱床吸附層析技術(EBA)是上世紀九十年代初期進入下遊生產，整合了發酵和下遊純化的技術。新一代STREAMLINE Direct擴張柱床設備及介質是EBA技術中最成熟的產品。通過條件優化，STREAMLINE能直接從渾濁的發酵液中捕獲目標生物分子，細胞碎片及不吸附的雜質穿過擴張床內懸浮的介質被衝洗掉，將以往澄清、濃縮、捕獲等步驟整合為一步，達到粗純化的效果(圖2)[17]。

　　STREAMLINE的操作過程如下[17-18]：(1)起始：將STREAMLINE介質倒入擴張柱中。(2)平衡：從下向上流的緩衝液，將STREAMLINE柱內的吸附介質懸浮起來，形成穩定的、充分平衡好的擴張床。(3)上樣：發酵液帶菌體從柱底進入，目標生物產品吸附在STREAMLINE介質上;不吸附的宿主雜質及菌體碎片隨液流從柱頂排出。(4)淋洗/穿透：進一步用緩衝液將不吸附的雜質洗掉。(5)洗脫：洗脫液洗脫目標生物產品。(6)CIP/再生：用1M NaOH+1M NaCl進行CIP。整個操作過程如圖3所示。

　　

圖2　傳統純化工藝與STREAMLINE [17]

圖3 STREAMLINE的基本工作原理和操作過程[18](箭頭示液體過柱時的流向)

　　STREAMLINE介質是一系列包裹著石英芯，以瓊脂糖為骨架的介質。特殊設計的STREAMLINE擴張柱床可以產生穩定的向上拔的擴張液流，每一顆不同比重的STREAMLINE介質，懸浮在自身重力和擴張升力平衡的位置原地擾動。STREAMLINE技術是穩態擴張，樣品流均勻分布整個床體，目標產物吸附均勻，穿透小，回收率高，類似於固定床吸附性層析[19]。

　　3. 抗體最新下遊技術應用實例

　　Lonza Biologics公司是全球最大的抗體合同生產商之一，為了開發一個穩定的20000L的抗體生產工藝，其純化開發部門對多個不同的抗體親和層析凝膠進行了有效的比較，他們發現Mabselect SuRe的動態載量高、使用壽命最長、Protein A脫落最低，實驗數據明確支持放大到1.4m直徑的柱子用於20000L培養規模的經濟生產[4]。

　　德國的Roche公司一種用於腫瘤治療的單抗已進入臨床Ⅲ期。他們將目前幾種Protein A介質進行充分的比較之後，選擇了高載量、更易於裝柱和壽命更長的Mabselect。目的抗體是通過無血清培養的轉染的雜交B淋巴細胞表達的IgG1。將過濾後的無細胞上清上樣到Mabselect填充的FineLINE柱，直徑300cm，柱高20cm，上樣的濃度是30mg/ml。洗脫後，洗脫液立即用磷酸鉀中和pH值到6.8-7.0，再用凝膠過濾檢測，結果表明比活超過90%，純度在95%以上[20]。

　　Cytheris公司是法國一家生物製藥公司，目前正在研製一種用CHO細胞表達的免疫調節劑(臨床Ⅱ期)。原先的工藝採用傳統層析法，但不能穩定去除病毒。改進後，在工藝的第一步使用Mustang Q對汙染物進行捕獲，取得了25%去除率的良好結果;同時對MVM、MLV和Re03三種病毒也達到超過4個Log的滴度降效果，而整個工藝對病毒的去除效率普遍提高了7-11個Log。說明Mustang Q的使用對下遊層析起到了很好的保護作用。

　　在第五屆生物製藥工藝優化大會上，Crucell公司介紹了他們對腺病毒(AAV)純化工藝的摸索。與傳統的層析填料相比，Mustang Q膜層析的開放孔道的設計使對病毒的動態載量大大提高30倍左右，回收率在80%以上。用40L的膜層析柱相當於1000L的傳統層析柱的效果，節省了驗證工作，提高了工藝經濟性，十分有利於放大生產。

　　德國的Boehringer Mannheim公司生物製藥部，用STREAMLINE技術代替傳統工藝生產400L CHO細胞培養的Fc融合蛋白，結果樣品回收率提高14%，緩衝液減少25%，時間縮短47%[17]。

　　世界最大的製藥公司-GlaxoSmithKline公司，使用特別設計的BioProcess全自動層析系統和STREAMLINE擴張柱生產藥用脂蛋白疫苗，比原工藝產品體積縮小2倍，純化係數1.5，內毒素減少100倍[17]。

　　日本YOSHITOMI公司正在使用多套STREAMLINE 1000系統生產人重組白蛋白，與原生產工藝產品純度相同，產率提高30%，時間減少一半，年產量為12.5噸[17]。

　　AVECIA公司重新設計臨床Ⅲ期藥品生產工藝，選用STREAMLINE技術及SOURCE新型凝膠，生產效率提高12倍，回收率提高1倍[17]。

　　2001年，ILEX製藥公司的CAMPATH獲得FDA批准。該單克隆抗體使用Sartobind Q離子交換層析模塊以流穿的方式進行精製，這是膜吸附器首次被批准應用於治療性蛋白的生產，證明了膜層析技術通過了證實和測試[30]。

　　4. 展望

　　隨著抗體產品上遊大規模高效培養技術的進一步發展,實驗室規模哺乳動物細胞表達水平可以達到25g/L，如果這一水平能夠有效放大到生產,將對下遊生產純化帶來更大的壓力。所以下遊純化工藝的技術發展也是勢在必行。

　　以下一些發展方向可能成為下遊工藝未來發展的重要關注點：(1)剛性更好、載量更高、耐鹼性更好的完全親水瓊脂糖凝膠的開發[4]。(2)優化操作次序，降低緩衝液消耗的更大規模生產線的應用[21]。(3)通過單抗的胺基酸序列預測下遊工藝關鍵參數：親和層析洗脫pH條件、離子交換層析洗脫pH和鹽濃度條件、病毒滅活pH等[22]。(4)下遊工藝的成本消耗佔全部成本的50-80%，親和捕獲是下遊工藝的最關鍵步驟，通過改進親和配體，提高捕獲能力，節省成本[23]。(5)新型層析系統全程實時控制純化過程，在線檢測HCP、宿主DNA、Protein A等的含量[24]。(6)由於在去除雜質方面的優勢，膜層析將會得到飛速的發展，未來工藝甚至可能完全基於膜層析而不是柱層析[25]。

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