抗體藥物作為作為一種高劑量使用的生物製劑，對產品純度以及雜質殘留量要求非常嚴格，另上遊表達量越來越高，產品要求也越來越高，隨之而來的是下遊純化壓力。如何快速獲得抗體的純化產品以及優化其生產工藝，成為藥物研發公司關注的要點。本篇文章介紹了抗體藥物發展史以及下遊純化工藝的基本流程，主要包括深層過濾，低pH滅活，中間品深層過濾，離子層析，除病毒過濾和超濾滲濾。
抗體是一類免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig），當母體受內源或外源物質刺激時，B淋巴細胞特異性識別抗原決定簇，從而促使一系列分化和分裂行為，B細胞的終末分化細胞即漿細胞合成了抗體。每一個B淋巴細胞只能分泌一種識別、結合抗原決定簇的抗體。單克隆抗體(Monoclonal antibodies，MAbs)是由B淋巴細胞和骨髓瘤細胞雜交形成的雜交瘤細胞產生的，具有高度均一性和特異性。
MAbs由兩條重鏈與兩條輕鏈構成[1]，其中重鏈分子量約為50~75KD，含約450~550個胺基酸，由一個可變區域V和三或四個恆定區域C組成，具有介導重要的免疫學功能，高等脊椎動物含有五種類型的重鏈（γ，μ，α，δ，ε）分別決定球蛋白的五種類型（IgG，IgM，IgA，IgD，IgE）[2]；而輕鏈分子量為25KD，含大約214個胺基酸，由一個可變區域V和一個恆定區域C組成，具有參與結合抗原並穩定免疫球蛋白結構的功能。一個二硫鍵將其中的一個重鏈和輕鏈連接起來，這些二硫鍵處在一個被稱為鉸鏈區(hinge)的柔性部位上，這個區域由12個胺基酸組成，且易於被蛋白酶或化學物質所切割。IgG可被木瓜蛋白酶水解為兩個相同以及一個不同片段，兩個相同片段在溶液或凝膠中不能形成片段且以單價形式與抗原結合，因此被稱為Fab 片段（Fragment antigen binding，抗原結合片段），另一個不同片段不能與抗原結合，且比Fab更容易產生結晶，其結構有更高的均一性，被稱為Fc片段（Fragment crystallisable，可結晶片段）[3]。抗體的重鏈以及輕鏈的可變區（VH+VL）稱為Fv片段（Fragment variable，不穩定片段），是一個能夠結合抗原的不穩定片段。可變區可被細分為高度可變區或者CDRs（complementarity-determining regions，互補決定區），該區域直接和抗原或框架區域（用作CDR與抗原接觸的支架）結合[4]。如下圖1-1：
圖1-1 單克隆抗體示意圖 圖1-2 單克隆抗體類型
Kohler和Milstein兩位科學家於1975年發明了單克隆抗體技術[5]，也因此獲得了1984年的諾貝爾醫學獎。隨著基因工程技術的迅速發展，治療性MAbs從早期100%的鼠源MAbs，到人-鼠嵌合抗體、人源化抗體，再到全人源性抗體（如圖1-2）並衍生出雙特異性抗體[6]，納米抗體等多種新型抗體藥物，逐漸解決了異源性抗體的免疫原性問題。以下是針對鼠源抗體到新型抗體藥物發展的相關介紹。
（1）鼠源抗體(Murine antibody)：使用異種抗原免疫小鼠，然後通過純化小鼠腹水得到針對該抗原的多克隆抗體，再經過骨髓瘤細胞融合得到可持續表達的單克隆抗體。1986年FDA批准的全球首個單抗Orthoclone-OKT，用於抗移植排斥的治療[7]。但是鼠源抗體可誘導產生HAMA（Human Anti Mouse Antibody，人抗鼠抗體），使鼠源抗體加速清除，增加病人後續應用的臨床風險。
（2）人-鼠嵌合抗體（Chimeric antibody）：恆定區來自人IgG，可變區來自鼠MAbs，是一個人-鼠雜合的抗體。該抗體不僅能大幅度降低異源抗體的免疫源性，其人源Fc片段還能有效介導生物學效應功能，如CDC（Complement dependent cytotoxicity，補體依賴性細胞毒作用），ADCC（Antibody-dependent cell-mediate dcytotoxicity，抗體依賴細胞介導的細胞毒作用）[6]等。
（3）人源化抗體(Humanized antibody)：小鼠CDRs與人的抗體框架嫁接，經親和力重塑，保留親本鼠單克隆抗體的特異性和親和力，幾乎完全去除免疫原性和毒副作用。
（4）全人抗體(Human antibody)：通過轉基因技術， 將人類編碼抗體的基因全部轉移至基因工程改造過的抗體基因缺失的動物中，從而使動物表達人類抗體，達到抗體全人源化的目的。
（5）雙特異性抗體（Bispecific antibody）：一種人造蛋白，由於重鏈與輕鏈來源於不同的抗體，所以可以與兩種特異的抗原結合。雙特異性抗體的優勢表現在：增強了腫瘤細胞的殺傷力，可以同時阻斷兩個不同信號路徑，通過兩個不同細胞表面抗原相互作用增加特異性結合[8]。
MAbs藥物因其靶向性強、特異性高和毒副作用低等優勢，迅速在腫瘤和自身免疫病等領域得到廣泛應用，市場規模成長迅速。據EvaluatePharma統計，全球在研抗體藥物佔所有在研生物藥的70%。至此FDA共有38個治療用抗體藥物（其中包括Fc和Fab融合蛋白）被批准上市（其中有2個抗體由於臨床在批准上市後退市）。2011年Top50生物藥物中有14個為抗體藥物，前6位全部是抗體藥物，年銷售額均超過￥50億美元。其中第一位是abbott公司的Humira，2011年銷售額達到79億美元。FDA批准的MAbs類藥物中40%用於治療癌症，33%用於治療自身免疫，10%用於器官移植治療，5%用於治療感染，12%應用於其他疾病。雖然生物技術製藥市場還比較小，例如在2011年生物技術製藥只佔全球藥物生產市場的15%，但是抗體藥物的複合增長率卻很高為40%。同時，各大原研單抗的專利陸續到期，EMA（European Medicines Agency，歐洲藥品局）和FDA生物仿製藥申報法規的陸續出臺，為單抗類生物仿製藥的井噴式發展提供了絕佳窗口。
中國的MAbs產業起步較晚，研發工藝能力與發達國家存在巨大差距，至2016年，本土研發生產並上市的單抗及Fc融合蛋白類產品僅10個。國內MAbs藥物行業面臨的主要問題有：
（1）動物細胞大規模培養表達量遠低於國外水平。國內細胞大規模的表達量一般在
0.5-1g/L，並且工業化生產規模小，最大的為3000L。而國外上市的藥物的表達量在2g/L左右，臨床的表達量在3-5g/L之間；
（2）MAbs純化工藝水平較低。FDA在2005年已經要求使用QbD（Quality by Design,質量源於設計）的研究方式研究生產工藝。現在國內僅有少數研發企業使用QbD的模式，而且多數企業使用傳統的研究方法。如何降低工藝成本，提高收率，提高工藝穩定性在抗體藥物研發中是非常重要的。
差距意味著潛力和機遇，國內腫瘤發病率持續上升構成的龐大市場需求，極大刺激了本土企業開發 「新藥創製重大專項」，在公布的2016年計劃資助100多個項目中，單抗項目數佔16%。據不完全統計，截止2016年11月，國內共有超過90家企業涉足單抗藥物研發，相關研發項目超過280個。不久後的中國單抗市場註定會呈現爆發式增長局面，預計2020年，將有6-10個新的本土單抗被推向市場。
近年來是MAbs發展的黃金時期，但是還需要面對另一個客觀事實：目前國際上針對熱門靶點的單抗項目眾多，比如針對TNF的項目超過40個，VEGF/VEGFR單抗項目超過35個，HER2超過25個。因此上市速度將會是決定產品市場地位的一個重要因素，而以高產能效率、高靈活性、低生產成本為主要特點的一次性技術產品，也必將在未來的生物工藝解決方案市場大放異彩。近幾年上市的MAbs體現了下一代MAbs藥物研發趨勢：
（1）減小MAbs分子量，從而更有利於藥代動力學以及藥效學參數，改善製劑的屬性，更利於生產。例如：單鏈MAbs以及MAbs的結構域。
（2）通過已知的藥物的分子模型創造新的藥物。兩個或兩個以上的生物功能分子形成融合蛋白，MAbs片段，形成多價或多特異性。例如：雙特體MAbs。
（3）提高新一代的MAbs的生產能力，以及其在生產過程中的穩定性和產品的穩定性。
（4）提高藥物的關鍵參數，如MAbs的半衰期和體內分布，免疫的安全性。
（5）提高藥理作用，即目標的特異性和結合特性，包括親和力和結合動力學。
在每一個生物技術工藝中，生物反應階段後要考慮進行兩個子工藝，即回收和純化，這兩步操作也被稱為下遊工藝。回收步驟包括培養基分離、細胞破碎、殘片去除等初步單元操作。殘留的產品實際上是包含目標蛋白且具有不同物理化學性質的蛋白複合物 [9]。可見，從如此混雜的蛋白中提取一種目的蛋白是一件非常艱巨的工作。故蛋白純化工藝應建立在良好的蛋白理化性質基礎之上，合理並充分利用處理技術方法和參數，儘量優化工藝步驟，設計一系列高效低耗和易於實行的蛋白質純化分離方案[10]。
在生物製藥產業，三步純化策略用於幫助治療性蛋白純化工藝的開發並且在實驗室開發純化方法時同樣有效。注意，三步純化策略並不是指所有的純化策略都應該包括這三部純化步驟。
（1）捕獲（粗純）
該步驟目的是分離、濃縮、穩定目標蛋白。產品被濃縮轉移到一個可以維持其效能、活性的環境。最好可以去除其他關鍵雜質。
（2）中間產品純化
該步目的是去除大部分性質相似的雜質，例如其他蛋白質和核酸、內毒素和病毒。
（3）精製
這一過程目的是去除一些微量的和分子量相近的雜質和多聚體。
下遊工藝先通過澄清發酵液捕獲MAbs，再通過一系列層析單元操作組合純化MAbs。該過程中還包括專門用於病毒滅活和去除的兩個正交步驟。然後通過滲濾和超濾步驟將抗體製成適於藥物產品製造的混合物和濃度。製成的產品經0.2μm除菌過濾器過濾，裝入適當的容器中並冷凍保存。MAbs下遊純化過程包括8個步驟，如圖2-1：
（1）深層過濾（Depth Filtration，DF）
也稱澄清過濾，屬於流體通過多孔介質的滲流[11]，用於系統清除殘留的固體和較小的細胞碎片。深層過濾器通過兩種主要機制確保顆粒和溶質的正常流動分離：篩分和吸附。基本過程分為兩個階段：第一階段是輸送階段，懸浮顆粒在多種力的作用下向濾料表面遷移[12]；第二階段是附著階段，顆粒在各種物理化學力、流體剪切力、碰撞力等的作用下附著在濾料表面並被截留、捕獲。其高容量是由於汙染物被捕獲並保留在介質的整個深度中而不是僅被保留在過濾器的表面上[13]。高表面積和帶電相互作用的可能性意味著深層濾器除了具有捕獲較大顆粒的能力之外，還具有吸附性能[14]。
（2）親和層析（Affinity Chromatography，AC）
親和填料含有一種名為Protein A的配基。Protein A，一種從金黃色葡萄球菌細胞壁中獲得的蛋白質，具有與免疫球蛋白選擇性相互作用的能力，IgG通過氫鍵和兩個鹽橋的疏水相互作用使其Fc區與蛋白A結合[15]。
AC是單抗純化第一步，可使蛋白純度達到95%以上[16]。該步驟目的是從澄清的收穫液中捕獲單克隆抗體，同時去除工藝相關雜質HCP（Host Cell Protein，宿主細胞蛋白），DNA和小分子雜質。
（3）低pH滅活
也稱病毒滅活，滅活可能存在於哺乳動物細胞培養物中的治療性蛋白質產品中的脂包膜病毒。脂包膜病毒的主要功能是幫助病毒進入宿主細胞。在pH3.9及以下可以有效滅活脂包膜病毒，pH越低，滅活病毒效果越好。
（4）陽離子層析（Cation Exchange Chromatography，CEX）
離子交換色譜分離生物分子的基礎是待分離物質在特定條件下與離子交換劑帶相反電荷因而能夠與之競爭結合[17]。該步驟的目的既將多聚物（蛋白質聚集體對治療性蛋白質產物的免疫應答構成風險[18]）降低至藥物的可接受水平，又將HCP降低到可接受的水平，以便後續的陰離子層析處理。
（5）陰離子層析（Anion Exchange Chromatography，AEX）
該步驟目的是去除HCP、DNA、Protein A和內毒素達到藥物的水平物質驗收標準。同時也起到病毒清除的作用。
（6）納濾（Nanofitration，NF）
為了保證產品安全，潛在的病毒汙染物通過使用傳統上被認為可靠的用於病毒清除的納米過濾器去除[19]。NF去除可能存在於哺乳動物細胞培養物產物中的細小病毒如小鼠微小病毒（minute virus of mice，MVM）和較大病毒如小鼠白血病病毒（murine leukemia virus，MuLV）。納米膜是一種功能性的半透膜[20]，NF只與目的蛋白和病毒分子的大小有關，依據蛋白分子量和膜截留量大小選擇合適孔徑的膜，以壓力差為推動力從而達到顯著去除病毒的目的[21]。
（7）超濾/滲濾（Ultrafiltration，UF/ Diafiltration，DF）
UF基於膜孔徑或分子量截留分離溶液中的分子（如圖2-2）。DF常用於在恆定體積下改變回流溶液的化學性質（如圖2-3）。 不需要的顆粒通過膜同時通過添加置換緩衝液將原料液的組成改變為更理想的狀態。在生物技術中，滲濾通常用於將產物交換到最終製劑緩衝液中[22]。UF和DF常使用切向流過濾[23]，其中料液平行流過膜表面而，過濾的同時也對濾膜進行了衝刷，使膜表面不會形成凝膠層從而使料液中的顆粒不會很快堵塞濾膜。該步驟目的是確保單克隆抗體製劑和濃度達到藥物規格。
圖2- 2 超濾裝置 圖2- 3 滲濾裝置
（1）實驗設計（Design of Experiment，DoE）
DoE顧名思義就是設計實驗的過程，用於收集易於用統計方法分析的數據，從而得出有效客觀的結論[24]。實驗設計在科學和工程學領域是改進產品實現過程非常重要的手段，也是製造過程設計與開發和過程管理中的重要元素。我們可把實驗看做科學研究的一部分，或將其視作過程運行方式和探究系統的一種途徑。一般來說，先針對某一過程提供一些猜測，接著進行實驗操作，然後產生這一實驗的相關數據，再利用來自這一實驗的信息設立另一個新的猜測，這一新的猜測又導出另一個新的實驗。
該技術允許我們通過少量的實驗獲得足夠多的數據，只需要在實驗過程中系統的改變實驗因素。基於所獲得數據可以建立一個用於研究工藝的數學模型，以此獲得實驗因素對結果的影響並找到最佳的工藝條件。可藉助現代軟體創建DoE、獲取數學模型、使產生的信息可視化。DoE常用的方法是確定一個中心點，然後圍繞改點進行代表性的實驗。DoE可以極大地提高篩選合適的實驗條件的效率。
（2）高通量篩選（High Through Screening，HTS）
為了提供一個簡單的用來優化純化MAbs的工具，人們在建立DoE與96孔板實驗結合的基礎上開發了HTS方法[25]。96過濾孔板可以根據實驗者的實驗設計需求自由填充不同微量的填料，孔板中層析填料和目標蛋白之間的基本相互作用和層析柱中是一樣的。HTS應用於早期層析篩選實驗，既節省時間節約成本又加速工藝開發和優化進程[26]。工藝開發過程中的HTS技術可以允許大型實驗空間的表徵、支持已經建立的良好的設計空間的確認從而控制被監測的關鍵工藝參數、減少臨床時間。
總結
抗體在下遊純化工藝中主要經過捕獲富集，中度純化去除大部分雜質，精細純化去除一些微量的和分子量相近的雜質，根據目的不同從而獲得較高純度的產品。
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