關於蛋白純化的技術分享

2020-12-05 艾柏森生物

隨著樣品的背景信息、分析方法和樣品的製備和提取步驟的進展，可以應用三步純化策略對樣 品進行純化。(下圖) 這個策略被用來幫助發展製藥工業中治療性蛋白的純化過程，同時在幫助研 究性實驗室研製純化方案時也是同樣有效。

目標分配

01 分配一個特定目標物到每一步

在三步純化策略中，一個特定目標物被分配到每一步中。純化問題與特定的步驟相關聯，在很大程度上取決於起始物質的特性。因此，一個純化步驟的目標物將依據它在純化過程的位置而不同，即在開始階段，將產物從粗製樣品中分離時，在中間純化階段，為了進一步純化已經部分純化的樣品時，或者在最後階段將純化好的樣品進行淨化處理。三步純化策略保證更快的純化方法進展和用更短的時間和更經濟的方式純化產品。在捕獲階段，將目標物進行分離、濃縮並且對目標物進行穩定化處理。目標物被濃縮和轉移到另外一個環境中，可以保存它的活性或效價。最終，其它關鍵汙染物被大量地去除。在中度純化階段，製品中的大量雜質已被去除， 例如其它的一些蛋白質和核酸、內毒素和病毒。在樣品精細純化階段，由於大量的雜質已經被去除，僅剩下一些痕量的雜質或者是與目標物非常接近的相關物質。製品完成了最終的純化。應該注意的是三步純化策略並不意味著所有的純化策略都必須經過三個純化步驟。例如，對靶蛋白的捕獲和中度純化可能在一個純化步驟中就完成了，或許中度純化和最後的精緻可能在一個純化步驟中就完成了。類似的，如果對純度的要求很低時，一個快速的捕獲步驟就足夠獲得想要得到的結果，或者製品開始的純度就很高，只要經過精細純化階段就可以達到需要的純度的產品。對於治療性蛋白的純化，或許需要四階段純化或者五階段純化步驟才能夠完全達到對 純度和安全性的最高要求。對於一個有效的純化過程，捕獲、中度純化和精細純化階段的優化組合是非常關鍵的。

02 純化技術的選擇和組合

樣品處理最小化

純化步驟最少化

在每一步驟中使用不同的技術

對於色譜分離技術而言，考慮到回收率、解析度、速度和容量等因素，每種不同的色譜技術將會得到不同的績效表現。一種色譜技術可能對於上述參數的其中之一是最優的，例如解析度或者在兩種參數間獲得最佳的平衡，例如速度和容量。對於按照這些參數其中之一進行優化的分離純化方法所產生的結果，與那些使用同樣的技術但是聚焦於一個可選擇參數所產生的結果有顯著不同。離子交換技術既可以用於捕獲階段也可以用於樣品的精細純化階段。

選擇一種技術滿足純化步驟所要求達到的目標

捕獲， 用簡單的模式表示，參考在純化過程中加載靶蛋白的總量。在一些情況下，加載樣品的總量或許會受到上樣體積的限制（如在凝膠過濾色譜中）或者受到大量存在於樣品中的汙染物的限制，而不是靶蛋白的總量的限制。

速度，在開始純化階段速度是一個最重要的環節，需要儘可能快地將樣品中的汙染物如蛋白酶等必須去除的物質除去。

回收率 在整個純化的進程中，回收率的重要性會逐漸增加，因為被純化產品的價值在逐漸增加。回收率受到對樣品破壞過程的影響和不適宜色譜柱條件的影響。

解析度 高解析度的獲得是通過對色譜技術的選擇和色譜介質的效率來形成一個很窄的色譜峰。一般情況下，在樣品純化的最後階段獲得好的解析度是非常困難的，因為這時樣品中的雜質和靶蛋白質的特性非常相似。每一種技術在解析度、速度、容量和回收率等參數中都達到了一種平衡，在樣品純化中，我們可以選擇這些技術來滿足對每一個純化步驟的要求。一般來說，如果使上述4個參數中的一個參數最優化，那麼將會以損失其它3個純化參數為代價並且純化步驟也會受到影響。

每一個純化參數的重要性是變化的，這主要取決於一個純化步驟是否用於捕獲、中度純化或者精細純化階段。這將指導關鍵參數的最優化，同樣也指導在每一步純化中選擇最適宜的介質。應用色譜技術對蛋白質進行純化，這些色譜技術的分離作用是根據樣品與雜質在某些特性方面的不同而進行分離的。

凝膠色譜技術能夠很好的適用於那些經過濃縮技術（離子交換、疏水層析、親和層析）處理過的樣品，因為目標蛋白經過洗脫後體積縮小，來自洗脫緩衝液中的複合組分不會對凝膠過濾分離產生影響。（凝膠過濾是一個限定體積容量和不受緩衝液條件影響的非結合技術）。最終純化策略的選擇總是取決於樣品的特殊特性和需要達到的純化程度。下圖所示的是各種純化技術的合理組合。

03

標準純化策略

使用一個組合的純化技術和選擇其中之一的純化技術對樣品進行純化。對於樣品而言，在一個離子交換—疏水層析—凝膠過濾層析三步純化策略中，捕獲階段的選擇根據電荷的差異（在離子交換中）、中度純化階段根據疏水性的差異和最後的精細純化階段根據蛋白質大小的差異進行純化的。下圖所示的是一個標準的三步純化策略

樣品條件

儘管我們要儘量避免在兩步純化之間對樣品進行額外的處理，但是對一個已經洗脫樣品的緩衝 液進行調節（pH、離子強度和/或緩衝離子對）或許是必要的，這樣可以保證樣品液與隨後所使用的純化技術具有兼容性。Sephadex G-25是一個用於在兩步純化之間通過緩衝液交換進行快速 脫鹽和調節pH值的理想介質。加載的樣品體積可以高達總柱體積的30%，或者在一些情況下達到總柱體積的40%。在一個單一的純化步驟中，樣品被脫鹽，交換到一個新的緩衝液中，並且 低分子量的物質被去除。圖7所示的是一個典型的脫鹽/緩衝液交換分離。高體積容量和速度使 得這一步能夠快速和有效的處理非常大的樣品體積。加載高樣品體積可以使在分離過程中對樣品的稀釋最小化。Sephadex G-25在實驗室規模的製備中也被用於快速樣品淨化。

01

對介質的考慮

Sephadex G-25 凝膠過濾法

在高分子量和低分子量物質之間進行快速的組分分離

典型的流速為60 cm/h (Sephadex G-25 Superne, Sephadex G-25 Fine), 150 cm/h (Sephadex G-25 介質).

在下面的捕獲章節、中度純化章節和精細純化章節中會進行更加詳細的討論。

注釋：

cm/h: 流速(線性流速) = 流過的體積/柱子的橫斷面積

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