輕鬆玩轉circRNA

2021-03-01 吉凱基因轉化醫學平臺

有別於LncRNA、mRNA、miRNA、snoRNA等這些線性的RNA，circRNA以其閉環特徵成功贏得了廣大科研工作者的青睞，成為近來研究的熱點。circRNA由特殊的可變剪切產生，廣泛存在於真核細胞內且表達有一定的組織、時序和疾病特異性。研究較多的功能為兩點：一是作為miRNA「海綿」充當ceRNA解除miRNA對編碼基因的翻譯抑制；二是結合轉錄相關複合物調控親本基因表達。

但如何實現「gain of function」及「loss of function」對很多人來說是難點。今天，我們就詳細地解剖下這個奇形怪狀的分子。

環狀RNA的形成

網站：http://www.circbase.org/

示例：以hsa_circ_0032627演示

打開http://www.circbase.org/，搜索hsa_circ_0032627，打開fasta

hsa_circ_0032627搜索結果

「circRNA sequence」選擇「spliced」，下方選「search」即可得到成環序列（CATTAACAACAGTGTCTTCAGTGTTCGCTTTTTCAGAACTACAGCTGTATGCAAGGATGACTTGGTTACAGTCAAAACCCCAGCGTTTGCAGAATCTGTCACAGAGGGAGATGTCAGGTGGGAGAAAG--兩個外顯子組成，標成了兩種顏色）；選擇「genomic」，下方選擇「Extend upstream by 1000 bases」即可得到上遊延伸1000bp的包含成環以及內含子的序列：

序列查找界面

         

① . 目前文獻多採用內源性的成環序列上遊臂1kb，並生成這1kb的反向互補序列作為下遊臂，將這兩個臂構建至成環序列上下遊並在成環序列兩端加上AG-GT剪切序列。這種包含ALU序列及穩定二級結構的構建方式成環效率最高。

主流構建法

② . 使用外源購買的固定臂載體，只需要構建成環序列即可。這種載體則是將1kb的側翼序列就行縮短及固定，並進行局部序列的優化。但目前測試成環不是很穩定，不做過多闡述。

由於很多環狀RNA屬於外顯子成環，所以，如果針對成環序列設計，靶點同時會脫靶至本底基因。由此，靶點只能設計在成環接頭處，一般一個環狀RNA只能設計1-2條靶點。直接在接頭處的40-45bp設計靶點即可。

接頭處：GAGGGAGATGTCAGGTGGGAGAAAGCATTAACAACAGTGTCTTCAGTGTT

靶點：GGGAGAAAGCATTAACAACAG

針對成環線性序列設計一對out-forward primer，設計原則等同於普通QPCR引物。

out-forward primer引物設計

很多小夥伴看不懂這對引物如何起作用的，那麼，把這對引物放到線性及環狀序

列上就很清晰了：

out-forward primers實際擴增環狀圖

將F,R之間的序列展開就能很清晰看到擴增序列以及擴增方式：

實際擴增線性圖

只要轉換成環序列的形式，就可以像操作mRNA那樣do circRNA，so，一起同吉凱探索環狀RNA的「藍海「吧！！！

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