lncRNA擺脫miRNA專題的補充：當lncRNA遇到m6A修飾

這周看文獻恰好瞄到一篇今年6月發表在oncogene上的研究，主題是關於lncRNA調控大名鼎鼎的m6A修飾。鑑於m6A的名聲在外，我覺得非常有必要寫這篇文獻的解讀作為lncRNA擺脫miRNA專題的補充。那麼，開始學習吧~

說起m6A（N6-methyladenosine）修飾，確實是最近幾年國自然的香餑餑。2018年國自然批准的項目中，m6A相關的研究多達65項，相比2017年翻了3倍；而到了2019年，m6A項目達到179項，比2108年又翻了一倍多。其實，早在1974年，m6A就被研究者檢測到(Desrosiers et al. 1974, Perry & Kelley 1974)，但由於缺乏檢測mRNA中m6A位點的方法，研究人員無法識別包含m6A的單個RNA，研究者對m6A作為mRNA調控模式的興趣很快消退。最近的技術進步（MeRIP-Seq）使得對m6A殘基的全轉錄組鑑定成為可能，這使得這一生物學標記成為新的研究熱點。

我們先來簡單了解一下m6A修飾的過程。m6A修飾指的是RNA上的腺苷酸（A）的第六位N發生甲基化。參與m6A的蛋白可以分為writers，erasers和readers三類，其中writers往核苷酸上添加上甲基，erasers去掉核苷酸上的甲基，readers則是能夠識別帶有甲基修飾的核酸序列。通過下面這張圖我們可以更好地了解這三者是怎麼行使功能的。

可以看到，m6A writer 複合物 (RBM15/15B-WTAP-METTL3-METTL14)和m6A eraser (ALKBH5)主要定位在細胞核內。因此，m6A對mRNA的任何動態調控都會在mRNA輸出之前發生在細胞核中。在細胞核中的m6A「印記」本質上是不可改變的，並決定了mRNA在細胞質中的命運。在細胞核中，m6A可以被m6A reader識別（YTH蛋白DC1）。在細胞質中，m6A可以被YTH蛋白DF1、DF2和DF3的識別。

好了，了解了m6A的基本情況，我們來看看這篇文獻是怎麼讓lncRNA在中間插一jio的。（LNC942 promoting METTL14-mediated m6A methylation in breast

cancer cell proliferation and progression，oncogene，IF：7.9，漲分了）

我們先通過機製圖來了解一下全文的大概思路。在乳腺癌細胞中，一條思路（支線）是，LNC942上調writer複合物組成蛋白之一的METTL14的 mRNA穩定性，使得METTL14蛋白表達升高。另一條思路（主線）是，LNC942與METTL14蛋白特異結合(+176 - +265)，增加METTL14的甲基化酶活性，上調下遊靶點CXCR4、CYP1B1 m6A甲基化水平，進而增強CXCR4、CYP1B1的mRNA穩定性和表達。

接下來我們看看具體的結果。作者先是在正常乳腺細胞系（MCF10A）和乳腺癌細胞系（MCF7）中進行測序得到差異表達基因，找到了LNC942這個高表達的lncRNA（fig1a），同時在多種乳腺癌細胞系中進一步驗證了LNC942的高表達（fig1b）。然後，通過starbase這個綜合性的預測網站，作者發現LNC942可能能夠與許多m6A相關的蛋白結合。所以在fig1c中，作者通過m6A dot blot assay驗證了m6A在各乳腺癌中的水平，發現MCF7和SKBR3中表達最高。然後，通過shRNA構建LNC942敲低的細胞系（fig1d）。

接上圖，作者發現敲降LNC942後，能夠顯著降低METTL14這個m6A writer複合物中的組成之一的表達（fig1e）。在組織水平，通過ISH, IHC, qPCR，驗證了LNC942，m6A，METTL14的表達在乳腺癌中升高（fig1f，fig1g）。最後，使用相關性分析，驗證了LNC942與m6A以及METTL14之間存在正相關（fig1h）。注意：在臨床水平中驗證你的關鍵分子A和B是否存在相關性是非常重要的證據。如果沒有數目可觀的臨床樣本，可以藉助TCGA資料庫來進行分析。

接下來作者從兩條線驗證了LNC942對m6A的調控，其中一條是直接調控METTL14的mRNA的穩定性。關於作者通過qPCR以及WB驗證沉默LNC942能夠抑制METTL14的mRNA和蛋白水平的結果由於篇幅的關係就不展示了，我們還是來看核心機制的驗證。在fig2f中，通過加入轉錄抑制劑處理細胞，發現細胞內殘留的METTL14隨時間減少（降解），而沉默LNC942能夠加速mRNA降解的速度。另外，m6A dot blot assay實驗驗證了LNC942沉默能夠降低細胞整體的m6A水平（fig2G）。其實我們可以看到，作者只是比較基礎地驗證了LNC942能夠維持METTL14的穩定性，但是對於中間的具體的機制是怎麼樣的，可能由於只是一條旁支的非核心機制路線，並沒有作深入的探討。結合我們之前推送的lncRNA與RBP來看，LNC942很可能也是通過結合某種RBP來調控RBP對於mRNA的穩定性的影響。

（相關閱讀：讓你的lncRNA擺脫miRNA的束縛（上））

我們接下來看作者怎麼驗證本文的核心機制，也就是LNC942影響METTL14的甲基化酶活性，作者先是通過ISH和IF驗證了LNC942與METTL14的共定位（fig4g），並通過RNA pull down驗證了LNC942與METTL14的結合（fig4h），這也是研究lncRNA與蛋白相互作用的基本方法。

接下來是尋找下遊受m6A修飾調控的靶基因，且這些靶基因要與腫瘤以及LNC942相關。通過KEGG分析列出十種可能與LNC942表達相關的細胞功能，其中兩種與腫瘤的發生有關（fig5a）。通過對這兩種細胞功能相關的候選基因進行m6A位點預測，發現CXCR4和CYP1B1具有高可信度的m6A修飾位點（fig5b）。接下來，作者通過測序結果，和qPCR驗證了CXCR4以及CYP1B1在乳腺癌細胞系中表達升高（fig5c，fig5d）。又通過WB和qPCR驗證了沉默LNC942會降低CXCR4以及CYP1B1的表達（fig5e，fig5f）。最後，由於m6A修飾會提高mRNA的穩定性，作者通過mRNA降解實驗發現沉默LNC942會加速CXCR4和CYP1B1的mRNA降解（fig1g）。

到這裡，作者做出了結論，CXCR4和CYP1B1可能是LNC942介導的METTL14調控的m6A修飾的新的候選直接靶點。但是，是不是感覺少了點什麼呢，感覺少了點什麼就對了。這裡作者缺少了對於CXCR4和CYP1B1的mRNA的m6A甲基化水平的檢測。此檢測使用的方法是m6A RNA免疫沉澱（m6A RIP），與一般RIP的操作相同，使用m6A的抗體得到RNA後，進行qPCR檢測。

雖然這個實驗還是挺關鍵的，但是野菜君覺得這也不影響這是一篇畢竟經典的關於lncRNA調控m6A的範文。在後續的結果裡，作者也通過回復實驗，驗證了過表達METTL14能夠逆轉沉默LNC942對CXCR4, CYP1B1，m6A水平，以及腫瘤表型的影響，證實LNC942確實通過METTL14發揮作用。我們可以跟著思路圖複習一遍本文的套路。

關於lncRNA與m6A的技術總結

1. 核心驗證內容：

① lncRNA對總m6A以及下遊靶基因（CXCR4, CYP1B1）水平的影響

② 對下遊靶基因的mRNA（CXCR4, CYP1B1）穩定性的影響

③ 與m6A修飾相關蛋白（METTL14）的結合。

2. 除了可以從lncRNA調控m6A入手，也有很多從m6A調控lncRNA入手的，這是兩個大方向。

3. 運用預測軟體預測候選靶基因m6A的位點也是非常重要的一步。

本期關於lncRNA與m6A的文獻解讀就到這裡了。是不是覺得m6A也沒有想像中的那麼難呢，其實就像之前說過的一樣，創新性神馬的，還是一個綜合的指數。做m6A一不小心也能做出2分的文章呢。當然，人還是要往高處看，最後再給同學們傳幾篇關於lncRNA與m6A的範例文章吧,先說一聲其中有一篇nature，可以慢慢享用。