定量磷酸化蛋白質組學 nature新發,擬南芥植物氣孔免疫調節機制

2021-01-08 鹿明生物

前言

感知生物和非生物脅迫通常會導致植物氣孔關閉。不同的環境刺激誘導胞漿中鈣離子濃度迅速增加，從而激活信號傳導反應。葉氣孔由兩個保衛細胞組成，介導水和氣體交換並表現出對刺激的動態鈣離子響應。氣孔為植物病原體提供了天然的入口點，因此必須嚴格控制其氣孔關閉，以確保最佳的光合作用，同時適當限制蒸發和病原體的進入。儘管鈣離子濃度在響應多種刺激的氣孔關閉中起著重要作用，但相應的鈣離子通道的身份仍然未知。

2020年8月，東英吉利大學Cyril Zipfel團隊在Nature發表題為「The calcium-permeable channel OSCA1.3 regulates plant stomatal immunity」（鈣離子滲透通道OSCA1.3調節植物氣孔免疫）的研究論文。研究團隊結合生化實驗和定量磷酸化蛋白質組學技術，揭示了擬南芥鈣離子滲透通道OSCA1.3控制免疫信號傳導期間氣孔關閉的機制。

中文標題：鈣離子滲透通道OSCA1.3調節植物氣孔免疫

研究對象：擬南芥

發表期刊：Nature

影響因子：42.778

單位：東英吉利大學

發表時間：2020年08月

主要運用生物技術：定量磷酸化蛋白質組學

研究方法及結果

在模式植物擬南芥中，質膜相關的胞質激酶BIK1充當多個細胞表面免疫受體下遊的中央免疫調節劑。BIK1協調多個由病原相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs）或損傷相關分子模式（damage-associated molecular Patterns, DAMP）觸發的免疫輸出。

先前的工作表明，BIK1直接將NADPH氧化酶RBOHD磷酸化，從而響應於PAMP或DAMP的感知而激活活性氧的產生。且BIK1已被證明與PAMP誘導的鈣離子內流和氣孔關閉有關。

作者因此假設BIK1可以直接磷酸化參與氣孔免疫的一個或多個未知Ca2+通道。擬南芥OSCA1.3是保守Ca2+通道OSCA/TMEM63家族的一個未表徵同工型，在PAMP處理後迅速被磷酸化。作者測試了OSCA1.3是否為BIK1的底物。與對照組相比，BIK1與OSCA1.3免疫共沉澱（圖1a）。使用來源於細菌鞭毛蛋白的多肽PAMP flg22（激活BIK1的免疫受體FLS2的配體）進行處理，不會改變OSCA1.3與BIK1之間的關聯（圖1a）。BIK1和OSCA1.3的關聯已在轉基因擬南芥品系中得到證實，但是flg22處理降低了這種關聯（圖1b），這與以前對BIK1-RBOHD關聯的觀察一致。

圖1 | OSCA1.3與BIK1相關聯

接下來作者測試BIK1是否使OSCA1.3磷酸化。先前報導OSCA1.3磷酸化位點位於第一個細胞質環中。體外pull down實驗表明OSCA1.3-loop1與GST-BIK1直接相互作用，並可以被磷酸化（圖2a，b），且這種磷酸化依賴於BIK1激酶的活性（圖2b）。在OSCA1.3-loop1中對已識別的磷酸化位點（S49和S54）和鄰近的S50進行定向突變，然後進行體外放射性激酶測定，結果表明BIK1主要使S54位點磷酸化（圖2b）。使用靶向定量蛋白質組學技術——選擇反應監測技術（SRM）在體內證實了flg22誘導的S54位點上BIK1依賴性的磷酸化（圖2c），進一步表明OSCA1.3是免疫信號傳導期間BIK1的底物。

圖2 | OSCA1.3被BIK1磷酸化，而S54是主要的磷酸化位點

擬南芥中有15種OSCA亞型，分為4個不同的系統發育進化枝。其中，僅OSCA1.1和OSCA1.2在植物中進行了功能鑑定，其參與了對滲透脅迫的響應。為了測試OSCA1.3是否為Ca2+滲透通道，作者使用了Ca2+攝取不足的酵母突變體cch1/mid1。與野生型酵母或表達OSCA1.3的cch1/mid1相比，該突變體未在浸有交配信息素α因子的濾紙圓盤周圍的光環中生長（圖3a），表明OSCA1.3在這個異源系統中促進了Ca2+轉運。此外，COS-7細胞的膜片鉗記錄揭示了OSCA1.3表達時的電流，在BIK1共表達時該電流以激酶活性依賴性和OSCA1.3-S54磷酸化依賴性方式增加（圖3b，c）。這些結果表明OSCA1.3是BIK1激活的Ca2+滲透通道。

圖3 | OSCA1.3是BIK1激活的鈣滲透通道

在擬南芥的OSCA進化枝1中，只有OSCA1.7在相同位置具有與OSCA1.3相似的Ser-X-X-Leu基序。同時在COS-7細胞中OSCA1.7介導的電流被BIK1活性激活。值得注意的是，單獨的OSCA1.3和OSCA1.7可以滲透Ca2+，並且在兩個通道共表達時該活性未增加。作者製作了一個雙重純合插入osca1.3/osca1.7（以下稱osca1.3/1.7）無效突變體。對加入Ca2+保衛細胞的單細胞測量表明，與野生型相比，osca1.3 / 1.7中flg22誘導的Ca2+的快速增加被減少了（圖4a）。

此外作者觀察到守衛細胞中flg22誘導的鈣離子濃度的增加量的減少與osca1.3/1.7中flg22誘導的氣孔關閉的消除有關（圖4b）。值得注意的是，用DAMP AtPep1處理後，osca1.3 / 1.7的氣孔關閉受到類似的損害（圖4c）。但是在osca1.3 / 1.7中響應植物脅迫激素脫落酸（ABA）的氣孔關閉不受影響（圖4c），完整葉片的氣孔電導測量結果證實了這一點（圖4d）。

這些結果表明，OSCA1.3和OSCA1.7的喪失通常不會影響保衛細胞的生理，表明OSCA1.3和OSCA1.7在免疫過程中對氣孔關閉具有特定作用。此外，osca1.3 / 1.7植物比野生型植物對低毒力的Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 COR菌株更敏感，其水平與免疫缺陷突變體bak1-5相似（圖4e）。最後，為了測試OSCA1.3 / 1.7的作用是否取決於BIK1介導的磷酸化，作者用OSCA1.3或OSCA1.3S54A補充了osca1.3/1.7。表達OSCA1.3，但不表達OSCA1.3（S54A）可以恢復flg22誘導的氣孔關閉（圖4f）。總之，數據表明OSCA1.3是氣孔免疫所必需的Ca2+滲透通道，其激活和功能取決於BIK1介導的磷酸化。

圖4 | 氣孔免疫需要OSCA1.3和OSCA1.7

實驗結論

本文運用定量磷酸化蛋白質組學技術報導了擬南芥Ca2+滲透通道OSCA1.3控制免疫信號傳導期間的氣孔關閉。該研究確定了植物Ca2+通道及其在免疫信號傳導期間激活氣孔關閉的機制，並揭示了Ca2+內流機制對不同脅迫響應的特異性。

文末看點

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文章來源於鹿明生物

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