原代培養又稱初代培養，是指直接從機體內獲取組織或細胞，接種培養至第一次傳代階段。一般持續1～4周。原代培養的細胞有貼壁生長和懸浮生長兩種。貼壁培養是根據胰酶的消化原理，使細胞間的蛋白質水解，細胞離散，然後加入適量的培養液，置於合適的容器內，在一定的溫度下進行培養。由於原代培養的細胞離體時間短，其遺傳性及細胞生物學特性與機體內細胞相似，故適於進行細胞形態結構、細胞分化、藥物測試等方面的研究。人和動物的大部分組織都可進行培養，幼體的組織和細胞更適於進行原代細胞培養。
（一）操作步驟
1.剪切組織 先將所取組織，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血汙，並用手術鑷去除黏附的結締組織等非培養所需組織。再次清洗後，用手術刀將組織切成若干小塊，移入小容器中，加入適量緩衝液，用眼科剪反覆剪切成糊狀。靜置片刻後，用吸管吸去上層液體，加入適當緩衝液再清洗一次。
2.消化分離 目的是將細小的組織塊消化分離成細胞團或分散成單個細胞，以利於進一步培養，常用的消化酶有胰蛋白酶和膠原酶。
3.培養 細胞懸液用計數板進行細胞計數，用培養液調整為（2～5）×105cells/mL，分裝於細胞瓶中，使細胞懸液的量以覆蓋後略高於培養瓶底部為宜。置CO2培養箱內，5%CO2，37℃靜置培養。一般3～5天原代培養細胞可以黏附於瓶壁，並伸展開始生長，可補加1/2原培養液量的新培養液，繼續培養2～3天後換液，一般7～11天可以長滿瓶壁，進行傳代。
（二）注意事項
1.無菌操作 細菌或黴菌汙染是培養失敗的常見原因，必須加強各個環節的無菌操作觀念。
2.培養液 所用的培養液必須滿足細胞生存和生長的必要條件。由於細胞來源的動物種類、組織類型不同，對培養液的要求有所差異。
3.小牛血清 對於維持細胞生存和促進細胞增殖起著關鍵作用，確定某廠家某一批號的小牛血清，就保持應用。
4.膠原酶溶液 必須新鮮配製，貯存時間過長，即使是-20℃保存，也將影響消化效力，導致消化時間過長而損傷細胞。
5.L-穀氨醯胺 幾乎所有細胞對穀氨醯胺都有較高的要求，細胞需要穀氨醯胺合成核酸和蛋白質，在缺少穀氨醯胺時，細胞會因生長不良而死亡。穀氨醯胺在培養液中很不穩定，加有穀氨醯胺的培養液在4℃冰箱貯存2周以上時，應重新加入原來量的穀氨醯胺。
6.靜置培養 原代細胞在消化分離後，置於CO2培養箱的頭24～48小時（必要時72小時）內，應處於絕對靜置狀態，切忌不時地取出培養瓶觀察生長狀況，這將使原代培養細胞難以貼壁，更談不上伸展和增殖。初學者尤應注意，不必擔心培養液中的營養成分會消耗光，細胞在增殖之前對營養的需求並不大。
7.消化時間 一般消化至肉眼尚可見微小組織顆粒即可，因為此時組織顆粒已經鬆散，略加吹打即成細胞團或單個細胞，過久消化往往導致細胞損傷加重，細胞培養成活率降低。