【實驗原理】
白細胞介素2（IL－2）主要由活化的T淋巴細胞產生，又為T淋巴細胞增殖所必需，故IL－2產生的水平可以反映T淋巴細胞的狀態。IL－2不僅是免疫調節重要的研究對象，而且與臨床多種疾病密切相關。CTLL是C57BL／6來源小鼠的殺傷性T淋巴細胞系，由Gills在1977年建立，這種細胞只有在IL－2存在的培養基中才能生長，因此可作為指示細胞來測定待檢樣品中IL－2的水平。除CTLL外，絲裂原活化的T淋巴母細胞亦可作為檢測IL－2活性的指示細胞。常用的方法有3H－TdR摻入法和MTT法，可根據所測的cpm值或od值反映活細胞的數量和活性，從而推知待檢樣品中IL－2的水平。
1.3H－TdR摻入法。
細胞增殖的基本條件或前提為細胞質和細胞核的複製，這是正常細胞增殖過程缺一不可的前提。通常一個細胞周期可大致分為四期，即G1期、S期、G2期和M期。其中S期為DNA合成期，主要功能活動為DNA合成。3H－TdR，即（甲基－3H）胸腺嘧啶核苷（［3H－methyl］thymidine），是DNA合成的前體，加入細胞培養液中後被細胞攝取作為DNA合成的原料。細胞合成的DNA越多，所摻入的3H－TdR就越多。因此，檢測所摻入的3H－TdR就可反映細胞增殖的程度。因該方法有同位素汙染問題，故實用性較差。
2.MTT法，即四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法。
MTT是一種噻唑鹽，化學名為3－（4，5－二甲基－2－噻唑）－2，5－二苯基溴化四唑，水溶液為黃橙色。小鼠脾細胞受到COnA作用後發生增殖活化，其胞內線粒體琥珀酸脫氫酶活性相應升高，MTT作為其底物參與反應，形成藍色的甲臢（formazan）顆粒沉積於細胞內或細胞周圍，經鹽酸異丙醇溶解後為藍色溶液，可用酶標測定儀測定細胞培養物的od值，測定波長為570nm。根據od值的大小計算反應體系中細胞增殖程度。
【材料與儀器】
1.10％小牛血清（或FBS）RPMI1640、IL－2依賴的CTLL、3H－TdR、標準IL－2、MTT、酸性異丙醇、二甲亞碸（DMSO）、二甲苯。
2. 「9999」型玻璃纖維濾紙、96孔平底培養板、細胞收集儀。3.CO2孵箱、ELISA測定儀、β液閃儀。
【實驗方法】
一、3H－TdR摻入法
1. CTLL用10％FCSRPMI1640洗滌2次，每次用1000r／min離心5min，除去原培養液中的IL－2。調整CTLL細胞懸液為1×105／ml。
2.96孔平底培養板中每孔加CTLL懸液100μl（1×104／孔）。加入不同稀釋度的標準IL－2和待測樣品，100μl／孔，置37℃CO2孵箱，培養18～24h。
2. 每孔加3H－TdR0.5μci／50μl，培養4～6h後，用多頭細胞收集儀收穫於「9999」型玻璃纖維濾紙上。乾燥後，移入液閃瓶中，加入1ml閃爍液。用β液閃儀測定cpm值（每min脈衝數）。二、MTT（四甲基偶氮唑鹽）法1.CTLL用10％FCSRPMI1640洗滌2次，每次用1000r／min離心5min，除去原培養液中的IL－2。調整CTLL細胞懸液為1×105／ml。2.96孔平底培養板中每孔加CTLL懸液100μl（1×104／孔）。加入不同稀釋度標準IL－2和待測樣品，100μl／孔，每份設3個重複孔。置37℃CO2孵箱，培養18～24h。
3. 每孔加10μlMTT（5mg／ml溶於PBS），37℃CO2孵箱培養4h，輕輕吸出150μl上清，加入150μl二甲亞碸（DMSO）或酸性異丙醇（異丙醇溶於0.04mol／LHCl溶液中），溶解10min，測od值（570nm）。
【實驗結果】
1.3H－TdR摻入法：將標準的不同濃度IL－2和待測樣品不同稀釋度時所獲得的cpm值作圖，縱坐標採用概率坐標（probit），橫坐標為log2稀釋倍數（圖10-1）。從50％的最高cpm值畫一橫線，取標準和待檢斜線的交點，即可計算出待檢樣品IL－2的活性單位。如標準品50％最大cpm值時為1U／ml，待測標本1∶4時為1U／ml，則原液為4U／ml。
2.MTT法：將標準IL－2不同濃度和待測樣品不同稀釋度時所獲得的od值作圖，計算出待檢樣品IL－2的活性單位。
【思考題】1.為什麼說IL－2產生的水平反映了T淋巴細胞的狀態？