貝勒醫學院《先進材料》3D生物列印-軟組織修復可炎症調節PVA支架

2020-12-27 Macromolecule

【科研摘要】

迫切需要臨床開發用於軟組織修復的炎症調節聚合物支架,以減少術後併發症。然而,用於疝修復的護理軟組織修復網的當前標準是高度發炎的,並且引發失調的炎症過程,引起內臟粘連和術後併發症。最近,美國貝勒醫學院Crystal S. Shin和Ghanashyam Acharya教授,萊斯大學Aparna Adumbumkulath教授,以及克裡斯特斯健康研究所Steven A. Curley教授團隊提出了用於軟組織修復的炎症調節生物材料支架(bioscaffold)的開發。相關論文3DBioprinted Inflammation Modulating Polymer Scaffolds for Soft Tissue Repair發表在《Advanced Materials》上。生物支架的設計基於以下思想:如果通過外科植入生物支架將過量的促炎細胞因子隔離在損傷部位,則可以調節炎症反應,並最大程度地減少內臟粘連的形成和術後併發症。生物支架是通過原位磷酸鹽交聯的聚乙烯醇聚合物的3D生物列印製成的。在大鼠腹疝模型中評估生物支架的體內功效。體內對組織的促炎細胞因子表達分析和組織病理學分析已證實,生物支架可充當炎症陷阱並捕獲植入部位分泌的促炎細胞因子,並有效調節局部炎症,而無需使用外源性抗炎劑。該生物支架在抑制內臟粘連形成和最小化術後併發症方面非常有效。

【科學背景】

軟組織損傷是由於肌肉或結締組織的弱化或破壞而發生的。最常見的軟組織損傷包括。腹壁薄弱,有缺陷和受傷會導致疝。這會造成腹部內容物可能突出的缺陷。疝的最常見類型是切開,腹股溝,股骨,臍帶和食管裂孔疝。疝的修復是通過外科植入義眼網來牢固地支撐和加固受損的腹壁並促進癒合過程(圖1A,B)。每年,要進行超過40萬例切口疝修補手術,美國醫療保健費用約為150億美元。人工疝網植入物是使用合成,生物和塗層材料開發的。儘管具有特定的優勢,但這些網狀植入物在最大限度地減少潛在的不良術後併發症方面不是非常有效。用網狀植入物進行的手術疝修復大多是由於網狀植入物內臟粘連,硬化和網狀收縮而失敗。內臟粘連是從胃,腸或結腸的下層漿膜形成的纖維組織,其附著在植入的網片上。這些粘附主要由膠原蛋白和成纖維細胞組成,它們生長在網狀物上並粘附在附近的組織,神經和器官上。隨著粘連的增加,網孔縮小,疤痕組織變硬,從而形成堅硬的纖維狀團塊,可能導致慢性疼痛,腸梗阻,腸瘻,不育,生活質量差和手術疝修復失敗。為了移除失敗的疝網,需要進行複雜的手術,其中必須將網從膀胱,胃,腸,結腸或主要血管上剝離,這可能對臨床結果產生不利影響。為了最小化粘附形成,移植物收縮和異物反應,已經開發了可吸收的和生物的網片。然而,由於非常高的疝復發率,這些網片並不是很有效。外科網片植入引起不良併發症的原因是慢性炎症反應,網片組織整合不良,材料的快速降解,網片的表面化學和拓撲化學設計。

圖1 生物支架設計和手術疝修復。A)示意圖,顯示內部器官通過腹疝突出。B)外科植入網以加強腹壁。A,B)經貝勒醫學院許可複製。C–E)示意圖描述了生物支架調節腹膜粘連形成的機制。C)對腹膜間皮層的損害,其中分泌了帶正電的促炎細胞因子。D)通過連接腹膜層和內臟器官的間皮形成粘附。E)植入帶負電的生物支架以在手術創傷後從受損的腹膜捕獲帶正電的促炎細胞因子。

生物支架的設計基於以下思想:如果通過外科手術植入帶負電荷的生物支架將過量的帶正電荷的促炎細胞因子隔離在腹膜損傷部位,則可以調節炎症反應,並使內臟粘連的形成最小化。生物支架充當炎性細胞因子的「陷阱」,並捕獲在手術疝修復部位分泌的促炎細胞因子,從而有效地調節局部炎症(圖1C–E)。該生物支架薄且柔韌,其拉伸強度被編程為與正常的完整腹壁的拉伸強度相匹配。這項研究還證明了合理設計和控制生物支架上的表面化學和電荷,以調節炎症並限制粘連形成,而不會損害大鼠腹疝模型的癒合過程。生物支架可防止術後內臟粘連的形成,而無需外源性抗炎療法。用於外科手術植入的生物支架旨在增強軟組織的癒合過程,並減少術後發病率,慢性疼痛和植入物相關的併發症。

【圖文精讀】

通過3D列印製造了具有原位磷酸酯交聯的聚乙烯醇聚合物(X-PVA)的生物支架。XPVA是由PVA與三偏磷酸鈉(STMP)在室溫下反應合成的(圖2A)。PVA是形成水凝膠的合成聚合物,通常用作藥物賦形劑和製造藥物輸送系統。STMP是用於交聯多糖的無毒環狀三磷酸酯。STMP通過磷酸酯基交聯多糖的羥基。通過3D列印製作生物支架涉及PVA和STMP溶液的逐層列印以及原位交聯,因此,可以通過優化陣列設計,生產線厚度和列印層數,以可重複的方式嚴格控制厚度和彈性模量。通過修改列印參數(例如針規,針壓,陣列設計和列印的層數),可以優化3D列印的生物支架的機械性能。對於本研究中的生物支架製造,組織使用了內徑為0.15毫米,長度為6.35毫米,針壓為0.17兆帕,針筒體積為10毫升的32號針頭。列印4、6、8、10和12層生物支架,並測試其彈性模量。基於這些研究,將八層的生物支架用於體內實驗。

圖2.生物支架的製造和表徵。A)PVA與STMP交聯反應形成磷酸鹽交聯的X-PVA。B)3D列印的生物支架。C–E)3D列印的生物支架展示了其柔韌性。F)使用10%PVA和15%STMP溶液製作了十層生物支架-10,八層生物支架-8和六層生物支架-6的彈性模量的曲線圖。G)經過數次應力應變循環後,生物支架8的縫合線保持能力一致。H)描繪包含不同磷酸鹽交聯密度的生物支架的ζ電勢的圖。使用10%PVA和15%STMP溶液製造高度交聯的Bioscaffold-A,使用10%PVA和10%STMP溶液製造中等交聯的Bioscaffold-B,使用10%PVA和7.5%STMP製造低交聯的Bioscaffold-C解。

生物支架柔軟,柔韌,並且在手術植入過程中易於操作(圖2B–E)。使用這種方法,通過添加3D列印策略製造了具有一系列機械強度的纖維生物支架。健康的個體在跳躍或咳嗽時產生的最大腹腔內壓力約為20 kPa,腹壁的彈性模量約為80 kPa。在這項研究中,通過添加3D列印製造了三個6、8和10個列印層的生物支架,它們分別是:生物支架-6,生物支架8和生物支架10。生物支架6的彈性模量約為400,生物支架8的彈性模量為700,生物支架10的彈性模量為1000 kPa(圖2F)。在圖2F中,該圖說明了樣品的彈性,曲線的終點是觀察斷裂點的位置。這項研究表明,生物支架8可以在不失敗的情況下保持縫合線高達100 kPa,這是健康人體內最大腹腔內壓力(20 kPa)的約5倍(圖2G)。

圖3 生物支架充當炎性細胞因子捕獲表面。A)示意圖,顯示了生物支架捕獲炎性細胞因子的體外策略。B–G)明場和螢光的疊加以及螢光共聚焦顯微鏡圖像表明:B)在生物支架表面上不存在細胞因子的情況下,抗體珠不結合;C)與吸附在生物支架上的TNF-α結合的TNF-α抗體珠;D)與結合於生物支架表面的IL-1α結合的IL-1α抗體珠; E)與吸附在生物支架表面的IL-6結合的IL-6抗體珠; F)與MIP-1α結合的MIP-1α抗體珠吸附在生物支架表面上; G)與吸附在生物支架表面上的VEGF結合的VEGF抗體珠。

如圖3A所示,通過基於珠子的生物測定法評估了生物支架捕獲帶正電的促炎細胞因子的能力。將一小塊生物支架(5 mm×5 mm)在細胞因子溶液中孵育,然後用水衝洗。然後將經細胞因子處理的生物支架與細胞因子抗體偶聯的螢光珠一起溫育,然後徹底衝洗。然後對生物支架進行螢光成像。這項研究表明促炎細胞因子TNF-α,IL-1β和IL-6與生物支架表面結合。圖3B–G顯示了明場的疊加,螢光圖像顯示了細胞因子結合的生物支架表面。為了清楚起見,螢光圖像顯示在疊加圖像旁邊。在生物支架表面上不存在細胞因子的情況下,抗體珠不與生物支架結合(圖3B)。TNF-α抗體偶聯的珠選擇性結合至生物支架表面吸附的TNF-α(圖3C)。同樣,IL-1α,IL-6和MIP-1α抗體偶聯的磁珠也選擇性結合至生物支架表面吸附的相應IL-1α,IL-6,MIP-1α和血管內皮生長因子(VEGF)(圖3D–G)。這項研究證實了生物支架捕獲炎性細胞因子的內在能力。

圖4生物支架在小鼠皮膚傷口模型中從傷口組織中捕獲促炎細胞因子。A–C)呈現未經處理的皮膚傷口(A),植入PROLENE網格的皮膚傷口(B)和植入生物支架的傷口的照片(用鑷子提起生物支架的邊緣以顯示存在皮膚 生物支架在皮膚傷口中)(C)。D)細胞因子濃度的RT-PCR分析表明,與PROLENE篩網相比,生物支架具有很高的捕獲促炎細胞因子的功效。

在疝修補手術患者的腹膜液中,檢測到促炎性細胞因子IL-1β,IL-6和TNF-α濃度增加,從而形成內臟粘連。因此,降低疝修補部位中這些促炎細胞因子的濃度對調節局部炎症和內臟粘連形成很重要。為了測試生物支架捕獲促炎細胞因子的功效,將生物支架植入小鼠皮膚傷口模型中,並與PROLENE網眼進行了比較(圖4A–C)。對於本研究,將雌性Balb/c小鼠(10周大)隨機分為兩組,並通過活檢穿孔器創建直徑1 cm的皮膚傷口。第一組植入PROLENE網片(直徑1釐米),第二組植入生物支架(直徑1釐米)。植入5天後,取回生物支架和PROLENE網並均質化以將捕獲的細胞因子提取到溶液中。提取的細胞因子溶液經過實時聚合酶鏈反應(RT-PCR)分析。這項研究證實了與PROLENE篩網相比,生物支架能夠以高濃度捕獲促炎細胞因子IL-1β,IL-6和TNF-α(圖4D)。

圖5 生物支架在大鼠腹疝模型中的手術植入後預防內臟粘連形成的功效。A)PROLENE網片,B,C)植入2周和4周後取回PROLENE網片,表明形成廣泛的內臟粘連。D)生物支架,E&F)植入2和4周後回收的生物支架。G)植入2周後,PROLENE網孔的H&E染色橫截面。黑色箭頭指向植入網的位置,紅色箭頭指向內臟粘連。H)植入2周後,生物支架的H&E染色橫截面。黑色箭頭指示植入的生物支架的位置,藍色箭頭指示不存在內臟粘連和新的腹膜層形成。I,J)2到4周後H&E染色的生物支架外植體橫截面的高倍放大圖像,表明在生物支架表面上形成了腹膜層。

為了評估這種新型生物支架在預防粘連形成中的功效,將其植入大鼠腹疝模型中。為了比較生物支架的功效,將商用聚丙烯網(PROLENE)用作對照,因為它在外科疝修復中具有廣泛的臨床應用。在本研究中,將Sprague-Dawley大鼠隨機分為兩組,第一組植入PROLENE網孔,第二組植入生物支架。在實驗過程中,動物沒有不適,行為改變或食物和水攝入減少的現象。在2周和4周的時間點進行屍檢後,從大鼠中取出生物支架,並檢查它們上的內臟粘連形成。在2周和4周的時間點,PROLENE網孔觸發了極高水平的腹膜內粘連形成網孔和腹腔內(圖5A–C)。植入後兩周,PROLENE網孔完全被粘連物覆蓋,縫合線和網孔不可見(圖5B)。在第4周的時間點,PROLENE網眼除了被牢固的粘連完全覆蓋之外,還緊密附著在下面的網膜,肝和腸上。這些粘連廣泛並密集新生血管。需要進行尖銳的解剖才能從PROLENE網片上剝離這些粘連(圖5C)。對於從大鼠回收的生物支架,在第2周和第4周的時間點均未觀察到粘連形成。生物支架和縫合線的邊緣清晰可見(圖5D–F)。

圖7 生物支架表面電荷對粘附形成的影響。 A)PROLENE網孔,B)生物支架,C)中性生物支架,D)聚賴氨酸塗覆的帶正電的生物支架,E)纖連蛋白塗覆的生物支架,和F)明膠塗覆的生物支架。G)RT-PCR分析促炎細胞因子的表達水平。

為了評估表面電荷對粘附形成的影響,製造了三種不同表面電荷的生物支架:1)帶負電荷表面的生物支架,2)帶中性表面的生物支架,和3)帶正電荷表面的生物支架。按照逐層3D列印方法製備,由於磷酸基團的存在,生物支架的表面帶負電荷。通過將材料浸泡在HCl中(1 m,30分鐘)以將帶負電荷的磷酸基團轉化為磷酸基團,來製備中性生物支架。將帶正電的生物支架浸入聚賴氨酸氫溴酸鹽溶液(0.1 mg mL-1,1 h)中以在其表面上形成聚賴氨酸單層。需要注意的重要一點是表面電荷的變化也改變了表面化學性質。為了評估表面電荷對術後粘連形成的影響,將這些生物支架植入大鼠腹疝模型中,並與PROLENE網孔進行比較(圖7A)。帶負電的生物支架在其表面上未引起任何粘附形成,並且縫合線清晰可見(圖7B)。在中性生物支架的情況下,觀察到廣泛的腹膜粘連形成,可能是由於表面上的酸基(圖7C)。在帶正電的聚賴氨酸塗層生物支架的情況下,再次觀察到廣泛的纖維化粘連形成(圖7D)。在這一點上,很好奇看到纖連蛋白和明膠包被的生物支架對粘連形成的影響。纖連蛋白是帶正電的ECM糖蛋白,在早期傷口癒合和組織修復中起關鍵作用。纖連蛋白和明膠包被的生物支架也可在2周內觸發粘連形成,儘管不如聚l-賴氨酸包被的生物支架那麼嚴重(圖7E,F)。為了在分子水平上評估表面電荷對炎症和內臟黏附形成的影響,分析了植入部位周圍組織的促炎細胞因子IL-1β,IL-6,TNF-α,TGF-β的表達水平。β和VEGF,並通過RT-PCR分析與PROLENE網格進行比較。這項研究表明,在中性和帶正電的生物支架中,促炎細胞因子的表達水平與在PROLENE網中觀察到的水平高。另一方面,帶負電荷的生物支架引起的炎症反應可忽略不計,促炎細胞因子的表達水平極低(圖7G)。綜上所述,帶正電和中性的生物支架引發了廣泛的粘連形成,這與PROLENE篩網所見的一樣重要(圖7A,C,D)。這項研究清楚地證明了生物支架表面負電荷在預防術後內臟粘連形成中的重要性。通過吸附單層帶正電的聚賴氨酸或纖連蛋白,生物支架表面電荷的輕度變化會產生更高水平的炎症細胞因子表達,從而形成覆蓋生物支架的血管化粘連,並將植入的材料連接至肝臟和腸。這些結果證實了生物支架設計中表面化學和表面電荷的重要考慮。

參考文獻:

doi.org/10.1002/adma.202003778

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