RT-qPCR的引物獲取有時就這麼簡單

2021-02-23 小張聊科研

靈敏的PCR反應，決定於所使用引物的特異性。特別是用於定量分析的基於Sybr green染料的 RT-qPCR，引物更是重中之重。初學者在師兄師姐們帶領下學習理解RT-qPCR技術時，可能更多是關注數據分析結果展示之類，而對引物的重要性認識不夠；在認識到引物的重要後，又往往去找各種引物設計軟體或是網上資料庫的使用教程，期以知道如何設計和獲取qPCR引物。

實際上，筆者認為，在2018年的今天，如果我們檢測的基因不是太新穎，我們也不用真的去關心引物的設計原則。

根據經驗，筆者推薦如下的順序進行qPCR引物獲取。

 

所需材料：

1、 一臺連網電腦

2、 可以上google

 

初級：直接獲取

優點：退火溫度統一為60，適合二步法，節約時間。

缺點：物種只有人和小鼠。

在直接獲取方面，一般人會是想到的是Primerbank、GETPrime、qPrimerDB、RTPrimerDB之類由學術界提供的網上資料庫。這是一個很好的方法，很多公眾號也在進行介紹，不少實驗室的人也是這麼做的。我個人認為，生物公司要提供的會比由學術界預測收集的要好一些。只是大部分提供RT-qPCR引物的公司，並不會主動提供引物序列消息。但總有例外，比如http://www.origene.com.cn/qPCR/primers.aspx，就會免費提供人和小鼠常見基因的RT-qPCR引物序列。下面以人的IFNG基因為例，在打開的網頁上直接輸入「IFNG」，並點擊GO。

 

得到引物序列後，可以在Primerblast（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）進行驗證。

 

更有趣的是，把這個序列在Google上搜索，得到85條結果

簡單看一下，還會發現找到的一些文章中有不少與IFNG研究相近的基因引物。點擊打開第一篇文章

可以在文章中發現同時有IL-10的引物。如果是用人的PBMC作為實驗材料的人，可以直接使用這些引物了。

進階篇：建立個性化RT-qPCR引物資料庫

網絡上的引物千千萬，文章中的序列數不清，但我們真正需要的只是能在我們實驗條件下能work的一條。而我們的實驗條件包括實驗材料（細胞系或原代細胞或組織）、實驗條件（退火溫度）。基於此，有必要建立起個性化的RT-qPCR引物資料庫。比如，以上的「HPRT Forward primer 5′-GAACGTCTTGCTCGAGATGTG-3′ and reverse primer 5′-CCAGCAGGTCAGCAAAGAATT-3′。在Google中可以找到很多附件，裡面就是包括了不少引物序列。而我們要做的是，下載其中的附件，對引物進行評價，並按下表建立起個性化的資料庫。另外也可以收集平時看到的文章中的序列，並記錄下基中RNA來源，所用試劑和反應條件等信息建庫。在進行實驗時，在個性化資料庫中找到最符合自己實驗條件的那條序列。


弱水三千，只取一瓢，引物也是適合的才是最好。

 

基金、課題設計、科研輔導群

備註：入群學習

從以下20個熱點入手，每天給大家分享乾貨：

1

miRNA非經典機制

11

腸道菌群

2

lncRNA的10種機制

12

細胞自噬

3

circRNA

13

細胞焦亡、鐵死亡

4

ceRNA

14

間充質幹細胞

5

轉錄因子

15

腫瘤幹細胞

6

可變剪接

16

外泌體

7

SNP

17

氧化應激

8

泛素化修飾

18

調節性T細胞

9

組蛋白修飾

19

RNA甲基化修飾

10

蛋白激酶和磷酸酶

20

腫瘤微環境

而這些研究方向參與疾病發生發展過程的分子機制，可以歸納總結為一下幾類研究：

①分子（DNA、RNA、蛋白質、小分子）的表觀遺傳修飾；

②分子拷貝數的表達變化差異；

③RNA分子的剪接加工、出核、細胞組織水平的時空變化研究；

④特殊的一群細胞類型研究、細胞通訊微環境研究；

⑤具有臨床應用潛力的新技術（CRIPSR）或者載體（膜結構、細胞等）；

⑥關注細胞生理學現象：自噬、凋亡、線粒體失功等；

相關閱讀：

長按二維碼識別關注「小張聊科研」

關注後獲取《科研修煉手冊》1、2、3、4、5、6、7，8

相關焦點

  • RT-qPCR引物設計5秒就夠了!
    【百度百科】而引物設計的好壞絕壁會是你qPCR中最為關鍵的一步，所以今天小編就給大家帶來了一些乾貨~大家有任何好的方法也歡迎再留言區留言哦~如果你問實驗室的小夥伴們，怎麼設計qPCR引物啊？1、引物應用核酸系列保守區設計並具有特異性。最好位於編碼區5'端的300-400bp區域內，可以用DNAMAN，primer5軟體看看結果。
  • NCBI--qPCR 引物設計
    引物參數欄中，前兩行是引物的序列欄，用於對已有的引物進行特異性分析，在設計引物的過程中並不會用到，因此留空即可。引物的Tm值一行中，可以設定引物的最大、最小和最佳Tm值，以及正反向引物Tm的最大差值。對於qPCR來講，默認的即為最佳Tm值60°C，不需做任何修改。
  • qPCR原理、qPCR引物設計、Excel數據處理模板
    實驗設計應避免引物中有4個以上連續重複的鹼基，推薦引物末端為G或C；引物設計的網站以上說了這麼多引物設計的原則，實際上有一些好用的網站，基本上考慮了qPCR引物設計的各種原則。這裡我推薦下面的引物設計在線網站。
  • 工具 懶人福音,分分鐘搞定qPCR引物
    引物設計是非常重要的一個環節，之前解螺旋也給大家分享了多種引物設計的軟體以及方法，在解螺旋的公眾號下回復「21」可看到《告別菜鳥——設計PCR引物「一招鮮」》，此文介紹了引物設計的原理以及如何在NCBI上查找序列再運用PP6等軟體設計引物；回復「318」可看到《如何用primer-blast設計和驗證引物》，此文推薦了NCBI的一款在線工具primer-BLAST，用於PCR的特異性引物設計和特異性檢驗
  • 什麼是RT-qPCR?
    通過RT-qPCR實驗，可以合成cDNA探針、獲取目的基因、以及分析基因的轉錄水平。從細胞、組織等樣本中提取出RNA後，需要對提取的RNA的純度、濃度、以及完整性進行評估，質檢達標後才能進行後續的實驗。
  • 更嚴謹的 qPCR引物設計方案(SYBR Green)
    設計qPCR引物（SYBR Green）我還沒失手過。 Online工具：1、  NCBI Primer Blast （設定參數，pick up特異性引物）https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?
  • 兩種RT-qPCR方法的優缺點比較
    2、在實驗設計階段非常省時，因為它只需要合適的引物設計。缺點：1、特異性不是很高。染料可以插入任何雙鏈DNA，包括引物二聚物和非特異性產物。2、如果引物二聚體存在或者產物受到汙染，得到的結果會不可靠。3、更容易與低豐度的目標產生非特異性螢光。需要更多的時間進行結果分析。
  • 玩轉qPCR系列 | 用Primer Blast快速設計探針引物
    這一部分對於設計用於真核生物的基因表達的引物很重要，可以設計跨外顯子的引物用於排除genomic DNA的幹擾。「Exon junction span」處選擇「引物必須跨外顯子設計」，「Exonjunction match」設定外顯子接合處兩端與引物匹配最少的鹼基數量，一般5『端要比3『端要多，因為3『的匹配對於啟始PCR非常關鍵，因此無需太多的匹配鹼基來保證這一點，默認參數基本可以滿足。
  • PCR引物如何設計
    若存在多個轉錄本，而要檢測的是目的指標的總的轉錄表達水平（不考慮剪接變異體）時，一般會取該指標的所有轉錄本的公共序列進行設計引物（如果沒有公共序列，則針對表達量最豐富的轉錄本進行設計）。當我們想檢測一個指標的不同轉錄本的表達情況時，這就要單獨對轉錄本的特有部分進行設計了。
  • RT-Thread 當前最新的 nRF24L01 組件這麼用
    點擊 user_guide.md 看到這麼一段代碼：Sugar 在 RT-Thread 社區上看到這麼個問題：nrf24->flags.using_irq) rt_thread_mdelay(10); } }static int nrf24l01_sample_init(void){ rt_thread_t thread; thread = rt_thread_create("nrf_mav", thread_entry, RT_NULL,
  • RT-PCR、qPCR、Real-time PCR...迷之概念,傻傻的分不清楚?
    即便如此，要想真正將該裝備應用的得心應手，仍不是一件簡單的事兒。總歸是需要對PCR進行全方面的細緻了解，畢竟知己知彼百戰不殆嘛。 PCR，學名聚合酶鏈反應，心靈手巧的它最擅長做的就是織圍巾將DNA分子套牢。換言之，就是在織圍巾（PCR）的過程中，將幾個元素織樣（模板）、起針（引物對）、毛線（dNTP）和針（Taq酶以及緩衝液體系）串起來，讓DNA分子無處可逃。
  • Primer Premier 5.0 引物設計軟體
    有時需要根據一段胺基酸序列反推到DNA 來設計引物，由於大多數胺基酸（20 種常見結構胺基酸中的18 種）的遺傳密碼不只一種，因此，由胺基酸序列反推DNA 序列時，會遇到部分鹼基的不確定性。這樣設計併合成的引物實際上是多個序列的混和物，它們的序列組成大部分相同，但在某些位點有所變化，稱之為簡併引物。
  • 引物設計的10款軟體(經典款+在線款)
    作為目前最好、最專業的引物設計軟體，Oligo的功能很強，其主要功能包括：普通引物對的搜索、測序引物的設計、雜交探針的設計以及評估引物對質量等等。它的引物分析功能如此強大以至於能風靡全世界。（文章連結：乾貨 | Oligo設計引物，就是這麼簡單） 3.
  • 科研軟體| Primer Premier 6引物設計安裝與使用
    有時需要根據一段胺基酸序列反推到DNA 來設計引物，由於大多數胺基酸（20 種常見結構胺基酸中的18 種）的遺傳密碼不只一種，因此，由胺基酸序列反推DNA 序列時，會遇到部分鹼基的不確定性。這樣設計併合成的引物實際上是多個序列的混合物，它們的序列組成大部分相同，但在某些位點有所變化，稱之為簡併引物。遺傳密碼規則因物種或細胞亞結構的不同而異，比如在線粒體內的遺傳密碼與細胞核是不一樣的。
  • PCR引物設計及軟體使用技巧
    引物設計的原則引物設計有3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或髮夾結構，再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA聚合反應(即錯配)。有時需要根據一段胺基酸序列反推到DNA來設計引物，由於大多數胺基酸（20種常見結構胺基酸中的18種）的遺傳密碼不只一種，因此，由胺基酸序列反推DNA序列時，會遇到部分鹼基的不確定性。這樣設計併合成的引物實際上是多個序列的混和物，它們的序列組成大部分相同，但在某些位點有所變化，稱之為簡併引物。遺傳密碼規則因物種或細胞亞結構的不同而異，比如在線粒體內的遺傳密碼與細胞核是不一樣的。
  • 如何在線設計引物
    因此，推薦幾個在線設計PCR引物的網站，只要打開網頁就可以，方便簡單，輕鬆搞定。（1）引物最好在模板cDNA的保守區內設計；（2）引物長度一般在15~30鹼基之間，過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於TaqDNA聚合酶進行反應；（3）引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。
  • 科研硬幹貨 | 一鍵搞定引物設計!
    在PCR(聚合酶鏈式反應)技術中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根據這一序列合成引物，利用PCR擴增技術，目的基因DNA受熱變性後解鏈為單鏈，引物與單鏈相應互補序列結合，然後在DNA聚合酶作用下進行延伸，如此重複循環，延伸後得到的產物同樣可以和引物結合。PCR引物設計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。
  • 用primer5設計引物教程
    下面，我認為大家已經安裝好該軟體 如果沒安裝的話，可以去搜索軟體簡單安裝。ps Premier由加拿大的Premier公司開發的專業用於PCR或測序引物以及雜交探針的設計和評估的軟體。其主要界面同樣也是分為序列編輯窗口（Genetank），引物設計窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和Motif分析窗口。這裡我們主要介紹其引物設計功能，顧名思義，該軟體就是用來進行引物設計的。可以簡單地通過手動拖動滑鼠以擴增出相應片段所需的引物，而在手動的任何時候，下面顯示各種參數的改變和可能的二聚體、異二聚體、髮夾結構等。
  • 技能|qRT-PCR引物設計
    方法2：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/1. cDNA序列的獲取選擇gene，輸入基因的名稱，如下圖，然後點擊Search4. 引物的設計在Analyse this sequence 列表中找到Pick Primers單擊，方法如下，進入引物設計頁面。當然也可在NCBI首頁的下部找到Primer-BLAST，單擊進入相同的頁面。
  • 常用引物設計工具大集合
    一款專業的引物設計軟體，具有PCR或測序引物以及雜交探針設計功能。可以簡單地通過手動拖動滑鼠以擴增出相應片段所需的引物，而在手動的任何時候，下面顯示各種參數的改變和可能的二聚體、異 二聚體、髮夾結構等。