PCR引物如何設計

2022-01-31 科研人直通車


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「小胡，老闆讓我跑一下PCR，具體我要訂什麼呀？」

「引物訂了嗎？」

「沒有呀，怎麼訂？」

說起Real-Time PCR，大家都不陌生，畢竟是檢測基因轉錄水平表達情況最基本的實驗了。但是對於沒有接觸過的小夥伴來說，還是挺陌生的，所需試劑儀器就先不聊了，今天小編單就lncRNA/mRNA引物設計來說道說道。

拿到一個指標，我們首先通過NCBI的gene查詢有幾個轉錄本。只有一個轉錄本的話，一切好說，直接拿序列。若存在多個轉錄本，而要檢測的是目的指標的總的轉錄表達水平（不考慮剪接變異體）時，一般會取該指標的所有轉錄本的公共序列進行設計引物（如果沒有公共序列，則針對表達量最豐富的轉錄本進行設計）。當我們想檢測一個指標的不同轉錄本的表達情況時，這就要單獨對轉錄本的特有部分進行設計了。

說了這麼多，那引物到底怎麼設計的呀？


總的來說，我們一般主要從4方面獲取，文獻查詢，PrimerBank，自己設計，外包公司設計。

1.     文獻查詢

我們把自己的指標輸入pubmed，然後著重看文章的材料方法部分。如果該文章進行了real time PCR實驗的話，那麼在材料方法區域會單獨作為實驗的一個分支標註出來（如下圖）。有的會提示引物序列具體見附表，有的則直接在材料方法給出，這樣就可以輕鬆得到引物序列啦。

註：Real-time PCR一般縮寫為 qPCR（quantitative real-time PCR），兩者表達意思一致。

當然，文獻可供選擇的引物有很多，但是儘量選擇高分文獻，畢竟可信度較高，IF不是說說而已的。

2.     PrimerBank

如其名，這是一個儲存引物的資料庫  （https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/） ，目前提供人和鼠兩個物種。具體操作很簡單，這裡輸入基因官方名稱後提交。

結果會顯示具體針對哪個轉錄本設計，引物長度，擴增產物長度，具體位置等。但是缺點是不能看到參考文獻，所以無從知道引物來自幾分文獻，所以拿到引物後儘量評價後再進行使用。具體評價引物質量的資料庫，咱們之前也介紹過了，大家根據那個操作即可。

3.     自己設計

（1）     在線設計

可供在線設計的資料庫相當多，這裡我們以NCBI的Primer-BLAST為例，簡要介紹一下使用方法。首先通過該資料庫連結：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/打開首頁，當然我們也可以從NCBI主頁面的下方導航欄進入（如下圖）。

NCBI下載目的RNA的鹼基序列（部分或全部序列）放入Primer-BLAST，或者輸入基因，按下圖所示操作進行後，點擊Get Primers。

然後會跳轉至以下界面。

結果主要包含兩個方面

一般會設計10個引物

Graphical view of primer pairs

以圖表形式顯示擴增產物的長度及位置（因為上述小編沒有選擇跨外顯子，所以下圖中的引物位置沒有跨外顯子）

Detailed primer reports

包含引物的詳細信息，如引物長度，開始結束位置，擴增產物長度，引物自身互補性等。

當我們有一對引物，想查詢其擴增產物長度及特異性時，也可以使用Primer-BLAST

粘貼引物後，點擊Get Primers。將會得到該引物的詳細信息。根據下圖，可以發現該引物沒有非特性性擴增。

（2）     專業軟體設計

例如Oligo，這裡就暫不過多贅述了，具體使用方法，網上教程很多。

4.     公司設計

當我們通過以上幾種方法得到的引物效果均不理想時，就找公司吧，具體操作：打錢就是啦。

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