1、引物最好在模板cDNA的保守區內設計
DNA序列的保守區是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟體（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區。
引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應大於38，因為過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於Taq DNA 聚合酶進行反應。
GC含量（composition）過高或過低都不利於引發反應。上下遊引物的GC含量不能相差太大。另外，上下遊引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高於Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復性條件最佳。
如擴增編碼區域，引物3′端不要終止於密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡併，會影響擴增的特異性與效率。
引物3′端錯配時，不同鹼基引發效率存在著很大的差異，當末位的鹼基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發效率大大降低，G、C錯配的引發效率介於A、T之間，所以3′端最好選擇T。
引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3』端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發（False priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種鹼基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續的G或C，因這樣會使引物在GC富集序列區錯誤引發。
引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會摺疊成髮夾結構（Hairpin）使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續4個鹼基的互補。
兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3′ 端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross dimer）的形成。引物之間不能有連續4個鹼基的互補。
引物二聚體及髮夾結構如果不可避免的話，應儘量使其△G值不要過高（應小於4.5kcal/mol）。否則易導致產生引物二聚體帶，並且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行。
△G值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結構內部鹼基對的相對穩定性，△G值越大，則雙鏈越穩定。應當選用5′ 端和中間△G值相對較高，而3′ 端△G值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3′ 端的△G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構並引發DNA 聚合反應。（不同位置的△G值可以用Oligo 6軟體進行分析）
引物的5′ 端決定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′ 端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、螢光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。 引物的延伸是從3′ 端開始的，不能進行任何修飾。3′ 端也不能有形成任何二級結構可能。
某些引物無效的主要原因是擴增產物單鏈二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區域。用有關軟體（比如RNAstructure）可以預測估計mRNA的穩定二級結構，有助於選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△G°）小於58.6l kJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。
引物設計完成以後，應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。
值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因為產物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，儘量去滿足條件。做Real Time時,用於SYBR Green I法時的一對引物與一般PCR的引物,在引物設計上所要求的參數是不同的。引物設計的要求： 1)避免重複鹼基，尤其是G. 2)Tm=58-60度。 3）GC=30-80%. 4)3'端最後5個鹼基內不能有多於2個的G或C.5)正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。6)PCR擴增產物長度： 引物的產物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80～150 bp最為合適（可以延長至300 bp）。7)引物的退火溫度要高，一般要在60度以上； 要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。
而且引物設計時應該考慮到引物要有不受基因組DNA汙染影響的能力，即引物應該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區，這樣可以更有效的不受基因組DNA汙染的影響。 至於設計軟體，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都應該可以的。
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