撰文 | Qi
責編 | 兮
了解基因功能是分子生物學的主要目標之一。質譜法可以觀察整個蛋白質組，當與傳統工具如親和純化或排阻色譜結合時，可以直接檢測蛋白質-蛋白質的相互作用，雖然功能強大，但這些方法是在細胞裂解後進行的，會改變蛋白質原始環境以及結合能力【1,2】。近年來高通量反向遺傳學（high-throughput reverse genetics）的發展徹底改變了我們繪製基因圖譜的能力，尤其是熱蛋白質組分析（thermal proteome profling, TPP），它將細胞熱移測定（cellular thermal shift assay， CETSA）與多重定量蛋白質組學相結合，可以深入了解蛋白質的原位狀態，反映特定蛋白質與代謝物，其他蛋白質以及和核酸等的相互作用【3,4】。
2020年12月9日，來自德國海德堡歐洲分子生物學實驗室（EMBL）的Athanasios Typas課題組和Mikhail M. Savitski課題組在Nature雜誌上合作發表一篇題為 The functional proteome landscape of Escherichia coli 的文章，在這項研究中，作者結合反向遺傳學和熱蛋白質組分析描述大腸桿菌中的遺傳擾動對蛋白質豐度和熱穩定性的影響，為推斷蛋白質功能和相互作用提供了豐富的資源。
首先，作者對121株大腸桿菌（大多數是來自Keio library的單基因缺失突變體）完成二維熱蛋白質組分析（2D-TPP），利用化學遺傳學數據以選擇突變體來幹擾不同的細胞過程。每一個突變體生長至指數階段，加熱至10個不同溫度以誘導蛋白質變性，隨後在每個溫度下進行細胞裂解並收集可溶性蛋白質部分，產生的蛋白樣品通過串聯質譜和定量蛋白質組學進行測定分析。在這個過程中作者建立了蛋白質豐度和熱穩定性變化的綜合數據集，鑑定出近70%的蛋白質在至少一次擾動中發生改變，且豐度和熱穩定性基本上是正交的。
由於必需基因（essential genes）的功能很難用遺傳學方法來研究，作者探討了必需基因如何在遺傳擾動中表現。結果顯示，由必需基因編碼的蛋白質通常豐度更高，但其豐度變化的頻率低於非必需基因編碼的蛋白質，此外必需蛋白質比非必需蛋白質更容易受到熱穩定性的影響，這提示它們的活性或相互作用可能在某些遺傳背景下受到調節。接下來，為了深入了解必需蛋白質熱穩定性變化的後果，作者使用CRISPRi降低不同遺傳背景下FtsK（一種細胞分裂DNA移位酶）和ParC（拓撲異構酶IV的亞基）的水平，僅輕微影響野生型細胞的生長，然而細胞不能耐受在熱穩定性受到影響的突變體中必需蛋白的消耗。這些數據提示細胞可以維持高水平的必需蛋白以緩衝它們在不同條件下的活性變化，這種必需和非必需基因的合成致死性可以為組合藥物治療提供新的途徑。
隨後，作者通過計算所斯皮爾曼等級相關係數來評估在不同溫度下121個遺傳擾動中哪些蛋白對的共同改變。需要注意的是，本研究測定的蛋白質熱穩定性能力能夠進一步捕捉蛋白間的功能關聯，例如RNA聚合酶的核心亞單位（RNAP；RpoA，RpoB和RpoC）之間的相關性更多是由於高溫引起的改變，儘管目前尚不清楚如何將熱穩定性與RNAP狀態相關聯。此外，在證實數據可重現已知生物學的基礎上，對未知功能蛋白即孤兒蛋白（orphan proteins）提供新的見解，共發現140個孤兒蛋白可能與已知的生物過程相關。
由於蛋白質的熱穩定性可以通過配體結合而改變，那麼作者想知道描述代謝途徑結構的能力是否與酶活性的變化以及代謝物水平的變化有關。為此，作者對本研究中包括的19個突變體和野生型大腸桿菌細胞中來自糖酵解和檸檬酸循環代謝物的相對水平完成量化，除發現代謝物水平的巨大變化之外，作者其與酶熱穩定性之間存在顯著相關性，但與酶豐度無關。這些數據提示，酶的熱穩定性可以反映作為底物或產物與酶直接相互作用的細胞內代謝物的水平。因此，TPP捕捉體內的酶活性，為細胞的代謝狀態和產生代謝途徑關聯的能力提供了一個獨特的視角。
最後，作者想知道蛋白質組的變化是否能解釋突變體在不同化學和環境脅迫下的生長表型。為此，利用來自化學遺傳學的數據集，將所有突變背景下檢測到的每個蛋白質的蛋白質豐度或熱穩定性與相同突變體在所有化學遺傳條件下的適應性相關聯，提供了不能單純通過基因缺失解釋的生長表型的新見解。
總的來說，這項研究系統地測定了121個大腸桿菌突變體中近1800個蛋白質的豐度和熱穩定性，並確定了10000多種潛在的新相互作用，其中也有部分涉及未知功能的孤兒蛋白。作者發現蛋白質的熱穩定性會直接受到結合蛋白的輔因子和代謝物水平的影響，提供了一種測量代謝活動的方法。最後，作者將本研究數據與現有大規模表型數據相結合，以獲得跳出敲除基因本身的條件生長表型原因的新見解，為成千上萬具有因果關係的蛋白質-表型聯繫打下基礎。綜上所述，本研究提供的數據集可用於深入了解蛋白質的功能和關聯性，並且這種方法可以擴展應用於其他生物體。
原文連結：
https://doi.org/10.1038/s41586-020-3002-5
參考文獻
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