前沿：
布魯頓酪氨酸激酶(BTK)是Tec家族非受體酪氨酸激酶的一員，在除T細胞和末期分化漿細胞外的所有造血細胞中表達。自身免疫性疾病如類風溼關節炎(RA)和紅斑狼瘡的潛在病理過程依賴於BTK調控的許多途徑，包括B細胞和髓細胞功能。
由於非催化半胱氨酸殘基(Cys481)在激酶結構域的適當位置，人們對鑑定共價結合Cys481的抑制劑特別感興趣。Ibrutinib是一種BTK的共價、不可逆抑制劑，被批准用於臨床治療慢性淋巴細胞白血病、套膜細胞淋巴瘤、瓦爾登斯特羅姆大球蛋白血症和慢性移植物抗宿主病。儘管依魯替尼取得了顯著的臨床治療效果，但是由於脫靶（EGFR）效應導致了副作用，如皮疹和腹瀉。
該公司前期已經成功獲得可逆的BTK抑制劑BMS-986142，正在進行治療風溼性關節炎的臨床試驗。因此，借鑑依魯替尼的共價設計，研究團隊在該化合物的基礎上進行了結構的設計。BMS-986142與BTK的共晶結果顯示，喹唑啉二酮的氧原子可與Cys481形成弱氫鍵，原子的間距比較接近，這為設計共價抑制劑奠定了基礎，設計如下所示：
化合物3a被證明是高效的共價BTK抑制劑，但是PK性質研究揭示了低血漿濃度，快速代謝產生苯胺代謝產物，性質不佳。後來修飾的二甲基吲哚支架的化合物3b和3c。保留了3a的高活性，然而仍未解決代謝問題。因此，研究團隊將修飾的策略轉為替換苯胺為脂肪環。
化合物4d是具有乙烯基磺醯胺受體的哌啶衍生物，維持著對BTK和Ramos的高抑制活性，且在肝微粒體中比較穩定。4d代謝的主要途徑是直接添加穀胱甘肽，而不是通過穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)介導，這對共價不可逆抑制劑是不利的。這表明，乙烯基磺醯胺受體的反應性太強。儘管具有高度反應性的受體，但在人類全血BTK失活實驗中，4d的失活率比1a的失活率要慢，如圖所示。
因此，研究團隊又轉向反應活性更低的受體，同時將哌啶環更換為其他的脂肪環，如下所示。
化合物4k和4f對Ramos的IC50均先於10 nM, 進一步的實驗表明使BTK滅火的速率與化合物1a相似。
為了提高代謝穩定性，研究團隊又在C4位置引入F原子，企圖封閉代謝位點，提高代謝穩定性。化合物5a維持著對BTK和Ramos的高抑制活性，對BTK滅火的速率比化合物1a高3倍，而發現去甲衍生物5b滅活BTK的速度比5a快7倍，在體內可能反應過度。
化合物5a在激酶組篩選中表現了超高的激酶選擇性，對具有類似半胱氨酸殘基的Tec家族、EGFR家族和JAK3中的部分激酶仍有高選擇性。尤其對EGFR家族激酶具有10000倍的選擇性，這也就避免了依魯替尼存在的EGFR脫靶造成的副作用。
共晶結果清晰的顯示：四氫咔唑的NH和羰基與Met477在活性位點的鉸鏈區域發生氫鍵作用。羧醯胺的NH2不僅與Glu475形成氫鍵作用，還與保守的水形成氫鍵作用，與守門分子Leu408殘基形成橋接作用。最重要的是，該結構通過與Cys481的硫形成明確的共價鍵，證實了該抑制劑的共價性質。
化合物5a對Ames毒性顯示陰性，hERG的IC50位11μM，對離子通道（Na，Ca）無明顯抑制。在四種種屬上的生物利用度均很高，清除率較低。
研究團隊後續進行了體內的關節炎實驗，0.5毫克和2.5毫克劑量依賴地對臨床疾病提供強有力的保護作用。實驗重點採血顯示三個劑量均高效的抑制BTK的活性。（BTK失活率高達99%）
總結：
研究團隊鑑定了共價不可逆BTK抑制劑的策略，該抑制劑既能在體內快速失活酶，又能降低人體預期劑量。探索親電受體與Cys481的低內在反應性結合，以減輕脫靶的副作用。此外，這一策略側重於識別具有PK/ADME特性的化合物，這種化合物能夠快速與靶標結合，但也能快速清除過量化合物。理想的安全性和耐受性方面更好,5a進一步被用於臨床評價。在第一階段的隨機、安慰劑對照、健康參與者的多上升劑量研究中，5a具有良好的耐受性，提供99%的BTK失活。這些數據與臨床前劑量預測一致，並高度支持對這種新藥的持續臨床研究。