2016年4月21日/生物谷BIOON/--大多數人類遺傳病是由於點突變---DNA序列上的單個鹼基錯誤---導致的。然而，當前的基因組編輯方法不能夠高效地校正細胞中的這些突變，而且經常導致隨機的核苷酸插入或刪除（insertions or deletion, indel）。
如今，在一項新的研究中，來自美國哈佛大學的研究人員對CRISPR/Cas9技術進行改進，構建出一種新的「鹼基編輯器（base editor）」，並且避免這些問題的發生。在人細胞系和小鼠細胞系中，這種鹼基編輯器永久性地和高效地將鹼基胞嘧啶（C）轉化為鹼基尿嘧啶（U），同時具有較低的編輯錯誤發生率。相關研究結果於2016年4月20日在線發表在Nature期刊上，論文標題為「Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage」。
美國加州大學伯克利分校基因組學創新計劃科學主任Jacob Corn（未參與者這項研究）說，「在人體的任何一個地方，都有大量的遺傳病存在，這些遺傳病本質上是由於鹼基換入或換出。」
在此之前，CRISPR/Cas9基因組編輯方法一直依賴於一種被稱作同源重組修復（homology-directed repair）的細胞機制，其中這種修復是由基因組DNA上的雙鏈斷裂觸發的。科學家們給細胞導入一種含有目標序列的DNA模板，並利用酶Cas9在這種細胞的基因組靶位點上進行切割，導致基因組發生雙鏈斷裂，然後等待一段時候後觀察這種同源重組修復是否將這種模板整合到基因組中，將雙鏈重新連接在一起。不幸的是，這種方法是低效率的（整合很少發生），而且經常在斷裂點附近以隨機indel的形式引入新的鹼基錯誤，從而使得它不適合用於點突變的治療性地校正。
因此，在哈佛大學化學家和化學生物學家David Liu的領導下，研究人員嘗試了一種不同的方法。首先，他們讓Cas9部分失活，使得它不能夠在細胞基因組上產生雙鏈斷裂。他們然後讓Cas9與一種被稱作胞苷脫氨酶的酶偶聯在一起，這樣就可在不用切割DNA的情形下，直接催化C變成U（本質上等同於胸腺嘧啶T）。將這種偶聯物導入細胞中，會在細胞基因組靶位點上產生一對錯配的鹼基對：一條鏈上新產生的U與另一條鏈上初始鹼基G錯配。Liu解釋道，「這種[錯配]讓DNA發生扭曲。它在DNA上產生一個有趣的但看起來並不正常的小凸起。」
這種凸起觸發一種不同的細胞修復機制，即錯配修復，這個修復機制移除錯配鹼基對（U-G）中的一個，然後用與剩下的鹼基互補的鹼基進行替換。在不知道哪個鹼基是正確的情形下，錯配修復產生所需的G→C轉換的概率是50%，另外，U→C轉換的概率也是50%。
但是當模板信息可獲得時，錯配修復確實還會進一步整入這種信息：它檢測到DNA骨架上被稱作缺口的小片段斷裂。Liu說，「細胞已進化出錯配修復機制來優先考慮舊有的DNA鏈而不是新合成的DNA鏈。新合成的DNA鏈往往存在一些缺口。因此，我們有理由相信我們可能能夠操縱錯配修復來偏好地校正我們不想要的DNA鏈，也就是含有G的那條DNA鏈。」
研究人員為此再次對Cas9進行基因改造，這次改造的目的在於讓它能夠在不進行基因編輯的含G的DNA鏈上產生缺口，同時讓需要進行基因編輯的含U的DNA鏈保持完整。Liu說，「這時，細胞會說，『哈，這裡存在一個鹼基錯配，發生錯誤的鹼基肯定是G，這是因為含G的DNA鏈存在缺口，而被細胞認為是新合成的DNA鏈。』它將偏好地對鹼基G進行校正，同時校正時利用另外一條鏈作為模板。」
通過在人細胞的基因組中的6個位點上使用這種技術，研究人員報導，正確的鹼基校正率高達37%，同時只有1%左右的序列發生indel。相反，在其中的三個位點上，利用正常的Cas9編輯技術進行測試，正確的校正率不到1%，而且4%以上的序列發生indel。研究人員還利用這種技術在小鼠細胞中將與阿爾茨海默病相關聯的APOE基因的一個高風險變異體轉換為低風險的基因版本，證實了這個技術校正疾病相關性突變的潛力。
Corn說，「通過對這種Cas9進行基因改造，他們找到一個非常好的方法誘騙細胞偏好選擇它通常並不偏好選擇的修復途徑。」然而，他提醒道，由於這種方法當前只能夠將鹼基對C-G轉化為U-A（亦即T-A），而且在一些情形下，它還會對與靶位點靠得很近的其他鹼基C進行編輯，「因此，它當然不是靈丹妙藥。這並不意味著你如今能夠治療每種遺傳病。但是很可能將有不少遺傳病可利用這種方法加以治療。」
英國牛津大學Tudor Fulga將這種技術稱為「一種構思非常巧妙的想法」，可以規避低效率的同源重組修復和降低不想要的indel產生。他告訴《科學家》雜誌，「我認為這將會在這個領域引發觀念轉變。這種基於Cas9的鹼基編輯方法很可能會產生非常巨大的影響，不論是在解答基礎研究問題的情形下，還是在基於基因組改造的治療應用方面。」
與此同時，還有兩篇文章同一天在線出現Nature期刊上。這兩篇文章都涉及Cas9的一種潛在替代者：Cpf1酶。CRISPR/Cpf1在細胞基因組靶位點上進行切割，產生「粘性末端（sticky end）」---切割的DNA上存在的突出末端，在DNA雙鏈斷裂位點的兩邊留下未配對的鹼基---而不是利用Cas9切割DNA雙鏈產生的平頭末端（blunt end）。
在其中的一篇文章中，來自德國馬克斯普朗克感染生物學研究所的Emmanuelle Charpentier和同事們證實不同於Cas9，Cpf1除了切割DNA外，還對RNA進行加工。相關研究於2016年4月20日在線發表在Nature期刊上，論文標題為「The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA」。（詳細報導參見生物谷新聞：Nature：重大發現！史上最簡單的CRISPR/Cpf1系統可切割DNA和RNA）
在另外一篇文章中，來自中國哈爾濱工業大學生命科學與技術學院的黃志偉（Zhiwei Huang）教授和同事們解析出CRISPR/Cpf1的晶體結構。相關研究於2016年4月20日在線發表在Nature期刊上，論文標題為「The crystal structure of Cpf1 in complex with CRISPR RNA」。（詳細報導參見新聞：Nature：揭示CRISPR-Cpf1識別crRNA以及剪切pre-crRNA的機制）
黃教授告訴《科學家》雜誌，「在細胞中進行DNA修復時，粘性末端要比[平頭末端]更加高效。我們認為[理解] Cpf1的結構將有助我們不僅知道Cpf1的工作機制，而且也有助設計更加特異性的和更加高效的基因組編輯工具。」（生物谷 Bioon.com）
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Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage
doi:10.1038/nature17946
Alexis C. Komor, Yongjoo B. Kim, Michael S. Packer, John A. Zuris & David R. Liu
Current genome-editing technologies introduce double-stranded (ds) DNA breaks at a target locus as the first step to gene correction1, 2. Although most genetic diseases arise from point mutations, current approaches to point mutation correction are inefficient and typically induce an abundance of random insertions and deletions (indels) at the target locus resulting from the cellular response to dsDNA breaks1, 2. Here we report the development of 『base editing』, a new approach to genome editing that enables the direct, irreversible conversion of one target DNA base into another in a programmable manner, without requiring dsDNA backbone cleavage or a donor template. We engineered fusions of CRISPR/Cas9 and a cytidine deaminase enzyme that retain the ability to be programmed with a guide RNA, do not induce dsDNA breaks, and mediate the direct conversion of cytidine to uridine, thereby effecting a C→T (or G→A) substitution. The resulting 『base editors』 convert cytidines within a window of approximately five nucleotides, and can efficiently correct a variety of point mutations relevant to human disease. In four transformed human and murine cell lines, second- and third-generation base editors that fuse uracil glycosylase inhibitor, and that use a Cas9 nickase targeting the non-edited strand, manipulate the cellular DNA repair response to favour desired base-editing outcomes, resulting in permanent correction of ~15–75% of total cellular DNA with minimal (typically ≤1%) indel formation. Base editing expands the scope and efficiency of genome editing of point mutations.
The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA
doi:10.1038/nature17945
Ines Fonfara, Hagen Richter, Majda Bratovi?, Ana?s Le Rhun & Emmanuelle Charpentier
CRISPR–Cas systems that provide defence against mobile genetic elements in bacteria and archaea have evolved a variety of mechanisms to target and cleave RNA or DNA1. The well-studied types I, II and III utilize a set of distinct CRISPR-associated (Cas) proteins for production of mature CRISPR RNAs (crRNAs) and interference with invading nucleic acids. In types I and III, Cas6 or Cas5d cleaves precursor crRNA (pre-crRNA)2, 3, 4, 5 and the mature crRNAs then guide a complex of Cas proteins (Cascade-Cas3, type I; Csm or Cmr, type III) to target and cleave invading DNA or RNA6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. In type II systems, RNase III cleaves pre-crRNA base-paired with trans-activating crRNA (tracrRNA) in the presence of Cas9 (refs 13, 14). The mature tracrRNA–crRNA duplex then guides Cas9 to cleave target DNA15. Here, we demonstrate a novel mechanism in CRISPR–Cas immunity. We show that type V-A Cpf1 from Francisella novicida is a dual-nuclease that is specific to crRNA biogenesis and target DNA interference. Cpf1 cleaves pre-crRNA upstream of a hairpin structure formed within the CRISPR repeats and thereby generates intermediate crRNAs that are processed further, leading to mature crRNAs. After recognition of a 5′-YTN-3′ protospacer adjacent motif on the non-target DNA strand and subsequent probing for an eight-nucleotide seed sequence, Cpf1, guided by the single mature repeat-spacer crRNA, introduces double-stranded breaks in the target DNA to generate a 5′ overhang16. The RNase and DNase activities of Cpf1 require sequence- and structure-specific binding to the hairpin of crRNA repeats. Cpf1 uses distinct active domains for both nuclease reactions and cleaves nucleic acids in the presence of magnesium or calcium. This study uncovers a new family of enzymes with specific dual endoribonuclease and endonuclease activities, and demonstrates that type V-A constitutes the most minimalistic of the CRISPR–Cas systems so far described.
The crystal structure of Cpf1 in complex with CRISPR RNA
doi:10.1038/nature17944
De Dong, Kuan Ren, Xiaolin Qiu, Jianlin Zheng, Minghui Guo, Xiaoyu Guan, Hongnan Liu, Ningning Li, Bailing Zhang, Daijun Yang, Chuang Ma, Shuo Wang, Dan Wu, Yunfeng Ma, Shilong Fan, Jiawei Wang, Ning Gao & Zhiwei Huang
The CRISPR–Cas systems, as exemplified by CRISPR–Cas9, are RNA-guided adaptive immune systems used by bacteria and archaea to defend against viral infection1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. The CRISPR–Cpf1 system, a new class 2 CRISPR–Cas system, mediates robust DNA interference in human cells1, 8, 9, 10. Although functionally conserved, Cpf1 and Cas9 differ in many aspects including their guide RNAs and substrate specificity. Here we report the 2.38?? crystal structure of the CRISPR RNA (crRNA)-bound Lachnospiraceae bacterium ND2006 Cpf1 (LbCpf1). LbCpf1 has a triangle-shaped architecture with a large positively charged channel at the centre. Recognized by the oligonucleotide-binding domain of LbCpf1, the crRNA adopts a highly distorted conformation stabilized by extensive intramolecular interactions and the (Mg(H2O)6)2+ ion. The oligonucleotide-binding domain also harbours a looped-out helical domain that is important for LbCpf1 substrate binding. Binding of crRNA or crRNA lacking the guide sequence induces marked conformational changes but no oligomerization of LbCpf1. Our study reveals the crRNA recognition mechanism and provides insight into crRNA-guided substrate binding of LbCpf1, establishing a framework for engineering LbCpf1 to improve its efficiency and specificity for genome editing.
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2016（第三屆）基因編輯研討會
會議時間：2016.06.25-2016.06.26 會議地點：上海
會議詳情： http://www.bioon.com/z/2016geneediting/