RNA提取方法 了解一下!

2021-02-08 杭州博日科技

RNA提取是分子生物學研究中最基礎的實驗之一，但RNA相比較DNA而言，因其易降解，經常讓新手哭笑不得。

RNA易降解原因

內因：RNA因其自身特殊結構，本身不穩定，另外RNA分子2』位置上有游離的羥基，易形成2』，3』-環形磷酸鹽中間產物，易分解。

外因：生物體內和外部環境中存在大量RNase，並且RNase不易失活。

炎炎夏日，何種方法能快速獲取RNA呢？


Trizol是一種傳統總RNA抽提試劑，內含含有酚、異硫氰酸胍和β-巰基乙醇等物質，能迅速破碎細胞，抑制細胞釋放出的核酸酶。酚能使核蛋白質與核酸解聚；異硫氰酸胍是一類強力的蛋白質變性劑，使蛋白質二級結構消失，細胞結構降解，核蛋白迅速與核酸分離；β-巰基乙醇主要破壞RNase蛋白質中的二硫鍵。

實驗準備

（RNA專用槍頭、EP管、PBS、Trizol、氯仿、異丙醇、75%乙醇、DEPC水（0.1%等）

樣本處理

（加入對應比例的Trizol組織液氮研磨後勻漿、培養細胞可直接收集）

（原則：確保裂解液能夠徹底樣本，保持溶液中核酸濃度適中）

離心後分三層：上層為水相的RNA；中層為DNA,脂類等；下層為細胞殘渣，蛋白，多糖等。

04

轉移水相

轉移水相時，槍尖隨著液面下移而下移，避免擾亂分層，慢慢吸取，避免吸到中間相和下層有機相。


加入等體積的異丙醇，混勻，靜置10分鐘後，4℃，12000g離心10分鐘。

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加入75%乙醇時輕輕加進去就好，避免把RNA沉澱吹散，RNA吹散後很難通過離心聚集到一起成為肉眼可見的沉澱，導致實驗的失敗。

配製Carrier RNA與裂解液的混合液

（Carrier RNA與裂解液混合後最多保存48小時，現配現用，成本高且操作繁瑣）




用BioEasy Master Mix (SYBR Green)做螢光定量PCR檢測

濃度檢測：

OD260/OD280：1.8-2.2

OD260/OD230：1.5-2.2

①   OD260/OD280 低於 1.8 表示有蛋白質的汙染 ；

②   OD260/OD230 低於 1.5 表明有明顯的有機物如糖、肽、苯 酚等的汙染。


電泳檢測：

1、RNA電泳共3條條帶，分別是28s、18s、5s。且第一條帶（28s）亮度應為第二條（18s)亮度的約2倍。最下面一條帶最淡，為5s條帶。如果5s條帶很亮，28s和18s不亮，說明RNA發生嚴重降解  

2、除了觀察電泳條帶亮度以外，要關注條帶拖尾現象，全泳道彌撒，則為存在雜質或者降解

不同方法提取ＲＮＡ優缺點對比


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