來源：來源網絡 2007-01-14 21:24
植物組織RNA提取的難點及對策
從植物組織中提取RNA是進行植物分子生物學方面研究的必要前提。要進行Northern雜交分析，純化mRNA以用於體外翻譯或建立cDNA文庫，RT-PCR及差示分析等分子生物學研究，都需要高質量的RNA。因此，從植物組織中提取純度高、完整性好的RNA是順利進行上述研究的關鍵所在。
從文獻報導上看，有許多植物就是由於未能有效地分離純化其組織中的RNA， 而阻礙了其分子生物學方面研究的進展。一般認為在這些植物組織中，或富含酚類化合物，或富含多糖，或含有某些尚無法確定的次級代謝產物，或RNase的活性較高。在完整的細胞內這些物質在空間上與核酸是分離的，但當組織被研磨，細胞破碎後，這些物質就會與RNA相互作用。酚類化合物被氧化後會與RNA不可逆地結合，導致RNA活性喪失及在用苯酚、氯仿抽提時RNA的丟失［1］，或形成不溶性複合物［2］；而多糖會形成難溶的膠狀物，與RNA共沉澱下來［3］；萜類化合物和RNase會分別造成RNA的化學降解［2］和酶解。對於這些植物材料，用常規的RNA提取方法（如胍法、苯酚法和十六烷基三甲基溴化胺法等）難以提取出其RNA。如Lбpez-Gбmez等在用常規的方法提取芒果果實的RNA時未能成功，他們的結果分為三種情況：提出的RNA已被降解；RNA的得率很低；得到的RNA不能進行體外翻譯。他們認為在果實成熟時各種酶的活性增強，其中也包含RNase，不溶性的澱粉轉化為可溶性的多糖，芒果果實細胞壁中特殊的成份，以及果實中高含量的多酚化合物都是幹擾RNA提取的因素［4］。Tesniere等在用苯酚法和胍法提取葡萄果實的RNA時，發現RNA與某種未知化合物凝聚成不溶性的複合物，並且這種未知化合物在230nm和270nm處有強的光吸收，從而幹擾了RNA紫外吸收的測定［5］。因此能否有效地去除多糖、酚類化合物、RNase和幹擾RNA提取的其它代謝產物是提取高質量植物RNA成敗的關鍵。本文根據文獻綜述了解決上述植物RNA提取過程中難點的相應對策。
1 酚類化合物的幹擾及對策
許多植物組織特別是植物的果實（如蘋果、櫻桃、李子、葡萄等）［6］和樹木類植物中［1］富含酚類化合物。酚類物質的含量會隨著植物的生長而增加。因而從幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，針葉類植物的針葉中多酚的含量比在落葉植物的葉子中要高得多［1］。在植物材料勻漿時，酚類物質會釋放出來，氧化後使勻漿液變為褐色，並隨氧化程度的增加而加深，這一現象被稱為褐化效應（browning effect）［7］。被氧化的酚類化合物（如醌類）能與RNA穩定地結合，從而影響RNA的分離純化。但Newbury等發現RNA提取的難易程度與材料中酚類物質的總量之間並無相關性，因此認為不是所有的酚類化合物都影響RNA的提取。但一般認為所謂的「縮合鞣質」即聚合多羥基黃酮醇類物質（如原花色素類物質）是影響RNA提取的一類化合物［8］。目前去除酚類化合物的一般途徑是在提取的初始階段防止其被氧化，然後再將其與RNA分開。
1.1 防止酚類化合物被氧化的方法
還原劑法：一般在提取緩衝液中加入(-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）或半胱氨酸［9］來防止酚類物質被氧化，有時提取液中(-巰基乙醇的濃度可高達2％［10］。(-巰基乙醇等還可以打斷多酚氧化酶的二硫鍵而使之失活。Su等認為在過夜沉澱RNA時加入(-巰基乙醇（終濃度1％）可以防止在此過程中酚類化合物的氧化。硼氫化鈉（NaBH4）是一種可還原醌的還原劑，用它處理後提取緩衝液的褐色可被消減，醌類化合物可被還原成多酚化合物［7］。
螯合劑法：螯合劑聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）中的CO－N＝基有很強的結合多酚化合物的能力，其結合能力隨著多酚化合物中芳環羥基數量的增加而加強。原花色素類物質中含有許多芳環上的羥基，因而可以與PVP或不溶性的PVPP形成穩定的複合物，使原花色素類物質不能成為多酚氧化酶的底物而被氧化，並可以在以後的抽提步驟中被除去［6］。用PVP去除多酚時pH值是一個重要的影響因素，在pH8.0以上時PVP結合多酚的能力會迅速降低［11］。當原花色素類物質量較大時，單獨使用PVPP無法去除所有的這類化合物，因而需要與其它方法結合使用［6］。
Tris-硼酸法：如果提取緩衝液中含有Tris-硼酸（pH7.5），其中的硼酸可以與酚類化合物依*氫鍵形成複合物，從而抑制了酚類物質的氧化及其與RNA的結合。這一方法十分有效，所以Lбpez-Gбmez等在提取緩衝液中不再加入其它還原劑［4］。但如果Tris-硼酸濃度過高（＞0.2M）則會影響RNA的回收率［7］。
牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素類物質與BSA間可產生類似於抗原－抗體間的相互作用，形成可溶性的或不溶性的複合物，減小了原花色素類物質與RNA結合的機會，因此提高了RNA的產量。BSA與PVPP結合使用提取效果會更好。由於BSA中往往含有RNase，因而在使用時要加入肝素以抑制RNase的活性［6］。
丙酮法：Schneiderbauer等用-70℃的丙酮抽提冷凍研磨後的植物材料，可以有效地從雲杉、松樹、山毛櫸等富含酚類化合物的植物材料中分離到高質量的RNA［1］。
Guillemant等［12］和Ainsworth［13］認為低pH值（pH5.5）的提取緩衝液可以防止酚類化合物的離子化和進一步的氧化。
1.2 酚類化合物的去除
通過Li+或Ca2+沉澱RNA的方法可以將未被氧化的酚類化合物去除。與PVP、不溶性PVPP或BSA結合的多酚，可以直接通過離心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提時除去［6］。Manning利用高濃度的2-丁氧乙醇（50％）來沉澱RNA，而多酚溶解於2-丁氧乙醇中而被除去。然後用含50％ 2-丁氧乙醇的緩衝液洗滌RNA沉澱以去除殘留的多酚。他認為即使多酚被氧化，其氧化產物仍可以溶解在高濃度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，無需再用NaBH4來處理［14］。
2 多糖的幹擾及對策
多糖的汙染是提取植物RNA時常遇到的另一個棘手的問題。植物組織中往往富含多糖，而多糖的許多理化性質與RNA很相似，因此很難將它們分開。在去除多糖的同時RNA也被裹攜走了，造成RNA產量的減少；而在沉澱RNA時，也產生多糖的凝膠狀沉澱，這種含有多糖的RNA沉澱難溶於水，或溶解後產生粘稠狀的溶液。由於多糖可以抑制許多酶的活性［15］，因此汙染了多糖的RNA樣品無法用於進一步的分子生物學研究。在常規的方法中，通過SDS-鹽酸胍處理可以部分去除一些多糖；在高濃度Na+或K+離子存在條件下，通過苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；通過LiCl沉澱RNA也可以將部分多糖留在上清液中［7］。但即使通過這些步驟仍會發現有相當多的多糖與RNA混雜在一起［13］，所以還需要用更有效的方法來解決植物RNA分離純化時多糖汙染的問題。
用低濃度乙醇沉澱多糖是一個去除多糖效果較好的方法。在RNA提取液或溶液中緩慢加入無水乙醇至終濃度10％～30％，可以使多糖沉澱下來，而RNA仍保留於溶液中。一般都是在植物材料的勻漿液中加入乙醇，如Lewinsohn等在從裸子植物的木質莖中提取RNA時，在勻漿上清液中加入乙醇至終濃度10％以沉澱多糖［3］。但Tesniere等在從葡萄漿果組織中提取RNA時，是在用CsCl超離心，乙醇沉澱之後的RNA溶液中加入終濃度30％乙醇來沉澱多糖的，進一步純化了RNA樣品［5］。
另一個常用的方法是醋酸鉀沉澱多糖法。Bahloul等在提取雲杉組織的RNA時在勻漿上清液中加入1/3體積的5M醋酸鉀（pH4.8）溶液以沉澱多糖［9］；Ainsworth在提取酸模植物花組織的RNA時加入的是1/5體積的5M醋酸鉀（pH4.8）溶液［13］。Hughes等在提取棉花葉和花粉的RNA時是加1/3體積的8.5M醋酸鉀（pH6.5）溶液到勻漿液中以除去多糖等雜質［16］。在提取某些植物材料的RNA時，是將上述兩種方法結合使用。如Lбpez-Gбmez等在提取芒果中果皮的RNA時，是在勻漿液中加入0.25體積的無水乙醇和0.11體積的5M醋酸鉀溶液以去除多糖雜質［4］。Su等在去除褐藻的多糖時，單獨使用乙醇或醋酸鉀都無效，只有兩者結合使用效果最佳［7］。
Fang等認為緩衝液中含有高濃度的NaCl有助於去除多糖［15］。Chang等在提取松樹RNA時，緩衝液中NaCl的濃度為2.0M和1.0M，通過氯仿抽提和乙醇沉澱RNA將RNA與多糖分離［10］。Manning是將胡蘿蔔種子等材料苯酚提取後的上清液稀釋，調節Na+離子濃度至80mM，然後加入0.4體積的2-丁氧乙醇來沉澱去除多糖［14］。
3 蛋白雜質的影響及對策
蛋白質是汙染RNA樣品的又一個重要因素。由於RNase和多酚氧化酶亦屬於蛋白質，因而要獲得完整的、高質量的RNA就必須有效地去除蛋白雜質。常規的方法是在冷凍的條件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性；提取緩衝液中含有蛋白質變性劑，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等，這樣在勻漿時可以使蛋白質變性，凝聚；有的方法是利用蛋白酶K來降解蛋白雜質。進一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白質。
Wilcockson利用蛋白質與RNA在高氯酸鈉溶液中的溶解度不同將它們分離。在70％高氯酸鈉溶液中，RNA的溶解度大於蛋白質的溶解度，因而將大部分蛋白質沉澱下來。接著在離心上清液中加入兩倍體積的無水乙醇，這時RNA能沉澱下來而能溶於70％高氯酸鈉溶液中的殘留蛋白質仍然留在上清液中。這樣可以除去絕大部分的蛋白質［17］。
4 次級代謝產物的影響及對策
從植物組織中提取高質量RNA的另一個難點是許多高等植物組織尤其是成熟組織能產生某些水溶性的次級代謝產物，這些次級代謝產物很容易與RNA結合併與RNA共同被抽提出來而阻礙具有生物活性的RNA的分離。因不能確定這些次級產物具體是什麼物質，所以，目前還沒有什麼特殊的方法來解決這個問題。Baker等［18］綜合Hughes等［16］的選擇性沉澱法、Chirgwin［19］的氯化銫梯度離心法和Iversen等的RNA回收方法純化了松樹種子、成熟松樹針葉等植物組織的RNA。
由於植物組織特別是高等植物組織細胞內外組成成分的複雜多樣性，使得植物組織RNA的提取相對於其它生物材料來說要困難的多。實踐中經常會發現，即使同一種植物的不同組織其RNA提取方法會有很大的不同；含有某種幹擾因素的不同植物材料，其適用的RNA提取方法可能不同；即使是同一種植物同一種組織材料，但來源於不同基因型植株，其RNA提取方法也可能不一樣。所以，對於某一植物或其組織來說，其相應的RNA提取方法必需經過摸索和實踐才能確立。
隨著植物分子生物學研究領域的拓寬，可以肯定地說，在作為其研究基礎的植物材料RNA提取過程中還會出現新的難點，但隨著不斷地探索和經驗的積累，科學工作者們一定會迅速地解決這些難點，為植物分子生物學的發展鋪平道路。
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