有觀點，有態度
這是醫業觀察公眾號的第763-1期文章
作者：水木木
近十幾年IVD行業在國內發展迅猛，筆者水木木有幸剛畢業就進入了IVD這個高速發展的行業，在POCT產品開發領域摸爬滾打多年，今天跟大家分享一下膠體金試紙條的開發過程，本來取名叫膠體金檢測試紙條開發乾貨，寫完發現自己才短思澀還達不到乾貨這個高度，僅僅只是對自身多年工作的一個小結，供剛入這行的同行們參考，一家之言，如果不妥之處請批評指正。
1 物料選擇及處理
物料是試紙條的硬體，物料的選擇和處理直接影響產品性能，下面從底片材、NC膜、樣品墊、標記墊、吸收墊來逐一講解。
底片材
底片材也叫背襯，主要是承載和黏合其它物料，也有些試紙條沒有底片材，只要能將其它物料組合在一起就OK。底片材的選擇要求不高，只要別粘性不好導致玻纖脫落或者太薄加烘後變形就好，國內市場上基本能滿足所以尺寸要求，實在不行就定製。
有一個需要注意的點，對於無背襯的NC膜，在做加速穩定的實驗時，底片材的膠有可能會滲入NC膜，導致C/T線出現一條很明顯的黑線，解決辦法是更換有背襯的NC膜或者更換原料點膜緩衝液。
NC膜
NC膜是整個膠體金試紙條免疫反應的載體，目前市場基本上被德國Sartorius、美國Millipore 和印度MDI三家佔領，其中Sartorius應該是最常用的，主要包括CN180、CN150、CN140、CN140Unbacked、CN110、CN95六種型號，數字越大膜孔徑越小，流速越慢，Millipore有HF180、HF135、HF120和MdI有15u、10u，具體參數大家可參閱相關COA。個人感覺Millipore性能綜合最佳，但是價格相對貴一些，供應不太穩定，可選擇用於一些流感、心肌等利潤較高的產品；Sartorius的CN140較為常用，項目前期可直接先用它來初篩原料，MdI 15u的背景很乾淨，可用於一些傳染病或者早孕產品。國內的基本上沒用過，這裡不作評論。
原料在包被到NC膜上之前需要稀釋到合適的濃度，包被的稀釋液相對來說較為簡單一些，PB或者PBS緩衝液最為常用，這兩者的緩衝體系對包被的抗原抗體都有較好的適應性，當然為解決某些特殊異常還會添加一些化學試劑，如添加海藻糖和蔗糖是為了保持良好的穩定性、TWEEN 20和EDTA是為了減輕部分反白現象、BSA和Casein作為封閉劑對膜進行封閉等。早期有些產品需要在包被T線的NC膜位置先劃一條封閉液進行封閉，現在的產品應該比較少了。
樣品墊
樣品墊能分離過濾樣品中的雜質，對樣品進行前處理，平衡待測試樣品的PH和調整鹽離子強度，使樣品在層析過程中保持一定的均一性和可控性。樣品墊的材料主要選擇玻纖、無紡布和濾紙，其中以Ahlstrom的8964玻纖較為常用。
樣品墊一般需要經過前期處理才能使用，處理液一般包含緩衝液、表面活性劑和其它生物原料。根據產品使用的樣本類型選擇合適的緩衝液，緩衝液主要包括Tris、硼砂和磷酸鹽緩衝液，尿液樣本硼砂緩衝液用的多一些，血液樣本Tris和磷酸鹽緩衝液用的多一些。表面活性劑用的較多的包括TWEEN 20、TRITON X-100、Tetronic 1307等，建議優先選擇非離子表面活性劑。其它生物原料的加入是為了解決跑板過程中出現的異常，如加入聚乙烯吡咯烷酮增加親水性，BSA、異嗜性抗體和酪蛋白可以特異性吸附雜蛋白，降低可能出現的假陽性，EDTA可以減少軌線和消除部分反白作用等。處理液還需要加入防腐劑疊氮鈉或Proclin-300，最後調節一個最合適的PH然後處理在玻纖上，烘乾即可。
標記墊
標記墊是膠體金顆粒附著的載體，有些試紙條沒有標記墊，將標記物直接點在樣品墊上或者NC膜上也能滿足要求，從精益的角度，少一種物料能省下很大量生產成本。具備非特異性吸附力低、標記物復溶和釋放力好的材料可用於標記墊，目前市場上標記墊主要用的材料是聚酯膜、玻纖和無紡布，其中芬蘭Ahlstrom的6613聚酯膜較為常用，項目前期可直接先用它來初篩原料。與樣品墊一樣，標記墊在噴點金標之前一般也需要進行前處理，處理液與上述相似，可根據具體項目配置合適的處理液。
吸收墊
吸收墊基本上都是選用濾紙，選擇要求不高，有良好的親水性和保水性即可。
2 原料標記
原料標記是膠體金試紙條最具有技術含量的環節，也是最為複雜、變數最大的環節，要講清楚這個步驟這點篇幅是完全不夠的，接下來從原料選擇、金水製備、膠體金標記各方面來簡單談談這一環節，最後再介紹一下乳膠標記。
原料選擇
抗原抗體原料是膠體金試紙條反應的核心，原料沒選好其它都白搭。目前市場性能好的原料大部分還是以進口為主，芬蘭的Medix和HyTest、美國的Merdian、Biospacific和Abnova等，國內菲鵬做的也很不錯。不過每個公司都有各自的優勢產品，大家根據自己的項目選擇合適自己的即可，很多公司會有試用裝，工作量接受的話可以把市面上有的原料都買回來試試。因原料的價格昂貴，而且原料的更換牽涉到產品註冊變更，費時費力，現在很多試紙條廠家開始自己研發原料，既省成本還能保證原料供應需求。
金水製備
膠體金是氯金酸與還原劑（如檸檬酸鈉）反應形成帶負電的疏水膠體溶液，反應過程顏色變化是淺黃色-透明-黑紫色-紫紅色，控制氯金酸與還原劑的比例可以得到不同粒徑的膠體金溶液，具體比例大家可在網上參照相關數據，通過肉眼觀察溶液顏色可粗略估計顆粒的大小。標記抗體原料選用40nm的粒徑較多，抗原和小分子蛋白選用20nm較多，當然也可以使用更大粒徑的顆粒，大顆粒靈敏度會相對好一些，不過特異性就很難保證了。
膠體金標記
膠體金標記是蛋白質結合到膠體金上的過程，金顆粒是一種特別嬌貴且有潔癖的微球，標記過程使用的器皿一定要保證足夠乾淨。
標記過程主要包括：1. 選擇合適的PH體系，膠體金顆粒與蛋白原料結合；2. 加入封閉劑對膠體金表面未與特異性蛋白結合的位點進行封閉；3. 高速離心濃縮膠體金溶液，最終的溶液OD值控制在130上下；4.最後去上清，加入適量保存液保持即可。
標記前一定要確定最佳的PH體系，一般選擇在略高於蛋白質PI，PH不合適很容易導致死金。蛋白原料的加入需要提前稀釋，高濃度的原料直接加入膠體金溶液也很容易死金，也可以嘗試反過來加，將膠體金溶液加入到原料中。針對某些重組抗原難標記，可以使用抗體搭橋標記，先標記一個重組抗原的標籤抗體，然後再與重組抗原結合。
乳膠標記
乳膠產品與膠體金產品除了標記物有區別外，其它基本上一致，所以這裡順便把乳膠標記也一起簡單介紹一下。乳膠顆粒的供應商主要有Agilent、Merck、Bangs、Thermo和旭化成，綜合評估旭化成的顆粒應該是最好的，不過也是最貴的。乳膠顆粒包括物理吸附和化學偶聯顆粒，目前化學偶聯顆粒用的比較多，偶聯過程分使用EDC活化的一步法和使用EDC+NHS活化的兩步法。整個偶聯過程比較簡單，按照說明書的步驟即可，當然針對不同原料需要選擇不同粒徑的顆粒和使用不用的封閉劑以及反應體系Buffer和PH。
3 試劑條結構
市場上常用的試劑條結構是樣品墊+標記墊+NC膜+吸收墊，隨著技術發展，為了滿足某些產品的特殊要求，試劑條結構也出現了一些微調，主要包括無標記墊結構、雙標記墊結構、橋墊結構和金標墊反粘結構等。
無標記墊結構
上述在標記墊那一節有說到這種結構，將標記物處理在NC膜上或者樣品墊上就可以省去標記墊。處理在NC膜上膠體金可能比較少，乳膠會多一些，使用這種結構靈敏度會弱一些，標記物釋放沒有那麼完全，建議對靈敏度要求不是特別高的或者靈敏度已經滿足要求的可以嘗試一下。
雙標記墊結構
這種結構常見於多對原料產品，比如HIV和Flu A&B，HIV包括Ⅰ型Ⅱ型和O型，因涉及到多種亞型，使用的原料比較多，全部處理在同一標記墊上可能相互會產品影響，影響產品性能，這時候可以選擇雙標記墊結構。有些產品因標記物釋放的影響，雙標記墊結構一般比用相同使用量的單標記墊靈敏度會高一些。不過這種結構會對後期生產增加難度，處理不當標記墊容易脫落，建議大家綜合評估之後再做選擇。
橋墊結構
橋墊結構是在樣品墊與標記墊之間加一段連接墊，對於樣品墊投放了反應原料的產品，橋墊可以使樣本與樣品墊上的原料反應更加充分，提升產品性能，對於樣品墊未投放反應原料的產品，橋墊可以減緩樣本流速，有助提高產品靈敏度。橋墊的材料與樣品墊一樣，主要是濾紙、玻纖和無紡布，也可以嘗試一下聚酯膜，橋墊也需要使用處理液進行處理。日本Determine HBsAg檢測試紙條就是這種結構，這款產品是目前我見過性能做得最佳的乳膠試紙條產品，不管是特異性還是靈敏度都值得我們學習，不過它好像不在中國上市。
金標墊反粘結構
金標墊反粘是將噴金的那一面朝下粘在底片材上，這種結構比較少見，結構的目的是為了降低金標的釋放速度，提高某些產品性能。
膠體金試紙條自90年代用於檢測人絨毛膜促性腺激素（HCG）以來，到現在檢測範圍已擴展到傳染病、毒品、流感、心肌、腫瘤標誌物、食品等多方領域，短短30多年已經發展成最為成熟、快速、簡單的體外診斷技術之一。
一根看似簡簡單單的試紙條，一個在10平米小型實驗室就能開發的診斷產品，卻養活了數家百億市值上市公司！
隨著新IVD檢測技術的發展，尤其近幾年化學發光、免疫螢光的迅猛發展，有人擔心膠體金會逐漸退出市場舞臺，其實我倒覺得沒有必要有這種憂慮，每種技術都有自己的市場定位。
膠體金試紙條的簡單、快捷、方便等優點幾乎很難被其它技術代替，假想一下，在一個偏遠的小山村，一警察抓住一個吸毒者，吸毒者非得說自己沒有吸毒，警察掏出試紙條，檢測了他的尿液，5分鐘後就能跟他說吸的是冰毒、古柯鹼還是嗎啡，這種技術是不是也很贊。
作者：水木木
2020.6.19