日前，高書山課題組構建了一種適用於多核工業菌的基因編輯系統，可實現大片段DNA無痕刪除，為我國微生物工業發酵菌株的遺傳改造提供了一種新型高效基因編輯工具，相關成果「A dual-plasmid CRISPR/Cas system for mycotoxin elimination in polykaryotic industrial fungi」已發表在合成生物學權威期刊ACS Synthetic Biology上。通過該方法，高書山課題組在紅曲紅色素多核生產菌Monascus purpureus中實現了內毒素桔青黴素生物合成基因簇（15 kb）的無痕敲除。新菌株經過科隆公司的小罐發酵、中罐發酵以及大罐發酵等層層嚴格驗證，發酵產品品質顯著高於目前市場上同類產品，已經應用於千噸級紅曲紅色素的工業生產，為企業取得了顯著的經濟效益。
紅曲紅色素是中華民族寶貴的科學遺產，被廣泛地應用於食品業的著色，也可以作為保健品緩解心腦血管和高血脂等相關疾病。但是紅曲紅色素工業菌株可同時生產具有腎毒性和致癌性的桔青黴素；我國和歐盟、日本等均對產品中桔青黴素的含量做出了限制性規定，我國標準為4 mg/kg。由於缺乏較好的遺傳操作工具，目前相關生產企業通過改變發酵工藝、隨機突變等手段，滿足桔青黴素含量標準，造成企業生產能力的巨大浪費；另一方面多數企業的紅曲紅產品因桔青黴素含量超標而出口受阻，降低了我國在該領域的國際競爭力。因此選育低產或不產生桔黴素的新紅麴黴工業發酵菌株迫在眉睫。
相較於放線菌等原核生物，多核菌基因組更為龐大和複雜、在單一細胞內存在不同的細胞核，普通基因敲除方法難以實現目標基因的徹底敲除，因此目前尚未有高效的基因編輯方法應用於工業多核菌株。針對這一困境，研究人員構建了一種新的雙質粒基因編輯系統：含密碼子優化後的Cas9質粒和含有目的基因上下遊同源臂的同源重組質粒。為了保證敲除效率，在Cas9質粒上引入了抗性基因和多核菌自主複製子。該方法成功實現桔青黴素生物合成基因簇（>15 kb）高效無痕刪除。LC-MS檢測結果表明，該方法得到的突變株經過10輪培養，仍未檢測到桔青黴素，且紅曲紅色素產量比改造前提高了約5%。
中國科學院微生物研究所助理研究員劉魏魏和博士後安春豔為論文共同第一作者，高書山研究員和美國萊斯大學化學與分子生物功能系助理教授高雪為共同通訊作者，向華研究員和華中農業大學陳福生教授對本文提供了寶貴的修改意見。本項目得到了國家重點研發計劃、中國科學院戰略性先導科技專項、國家自然科學基金以及中國科學院交叉創新平臺等項目經費的大力支持。高書山課題組感謝陳義華研究員、範克強研究員、王為善研究員以及潘國輝研究員給予寶貴的實驗空間。
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https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acssynbio.0c00178