本文由「山中麻署」授權轉載
背景
自閉症譜系障礙（autism spectrum disorders，ASD)是一組由多種神經發育性疾病組成的症候群。在ASD目前的診斷標準(DSM-5)中，感覺異常位列其中，包括對感覺輸入的過度反應/敏感，然而其機制目前尚不清楚。人類功能性核磁共振成像（fMRI）和動物模型研究表明，皮質神經環路異常可能導致ASD患者對感覺輸入反應異常，但缺乏直接的證據。
近年來，皮質GABA能中間神經元受到越來越多的關注，許多ASD動物模型中觀察到中間神經元功能障礙。最近有研究發現，GAGB能神經元缺陷與ASD小鼠模型的多感覺整合障礙有關。然而，皮質GABA能神經元功能障礙與ASD感覺異常之間的直接因果關係尚未明確。
SHANK3基因家族編碼突觸後蛋白，在興奮性突觸的形成、樹突棘發育和穀氨酸受體功能維持中發揮著重要作用。已有許多研究證明SHANK單基因突變即可導致ASD的發生。Shank3B敲除小鼠（Shank3B-/-）是目前研究ASD的重要動物模型之一。利用該模型，本文揭示了抑制性中間神經元功能在ASD感覺異常中的關鍵作用。
Step1 確認Shank3B-/-小鼠對感覺過敏
作者訓練Shank3B-/-小鼠和對照組的野生型（WT）小鼠進行「觸覺感知任務」。實驗前限制小鼠攝入水，實驗時固定小鼠頭部，通過電壓傳感器刺激小鼠的鬍鬚，對小鼠進行訓練，使其每次感受到鬍鬚被刺激時，舔舐出水口。刺激的強度由刺激的振幅決定。將hit與真實刺激次數的比值定為命中率，false positive與未刺激次數的比值定為假陽性率。用命中率和假陽性率的估計值，根據信號檢測理論，計算每隻小鼠的敏感指數d'。d'值越大，敏感性越高。此外對Shank3B-/-小鼠和WT小鼠的運動能力進行了測試和對比，排除實驗組和對照組小鼠運動能力的差異。實驗結果顯示：對於強刺激，Shank3B-/-和WT小鼠的d'值無顯著差異；而對於較弱的刺激，Shank3B-/-小鼠的d'值明顯高於WT小鼠，即Shank3B-/-小鼠更敏感。為測量兩種小鼠的感受閾值，構建心理測量曲線來呈現刺激幅度與命中率之間的關係。結果顯示Shank3B-/-小鼠的感受閾值明顯低於WT小鼠。這些結果表明，Shank3B-/-小鼠對外界刺激出現感覺過敏，這和ASD患者的臨床症狀非常相似。
Step2 Shank3B-/-小鼠皮層自發性以及
刺激引發的神經活動增加
為了研究感覺過敏現象的神經網絡機制，對頭部固定的清醒的Shank3B-/-小鼠和WT小鼠進行在體大規模雙光子鈣成像。使用興奮特異性的人CaMKIIα啟動子驅動鈣指示劑GCaMP6f的表達。由於軀體感覺皮層對微弱刺激最為敏感，接近於感知閾值，結合第一部分行為學結果，故選擇小鼠初級軀體感覺皮層（vS1）作為觀察範圍。結果顯示，與WT小鼠相比，Shank3B-/-小鼠的興奮性神經元自發活動增強，並且配對關聯性增加。神經元關聯性出現差異的原因之一是興奮和抑制平衡的改變。在WT小鼠中，神經放電頻率與關聯性呈現線性關係；在Shank3B-/-小鼠中兩者關係曲線更平坦。這些結果提示Shank3B-/-小鼠中神經元關聯性的增加是神經環路的改變而不是單純放電頻率的改變。
隨後對刺激引發的神經活動進行研究。刺激方式同第一部分。WT小鼠中在觀察區域內對刺激產生反應的神經元佔0.26±0.08，而Shank3B-/-小鼠中為0.52±0.11，不僅如此，反應強度也增加。以上結果均提示第II/III層的錐體神經元對外界刺激更為活躍和敏感。
Step3 Shank3B-/-小鼠抑制性體感皮層神經元活動減弱
既往研究發現，敲除Shank3基因會導致穀氨酸能突觸傳遞能力降低，而本研究卻觀察到興奮性神經元活性增高的現象。皮質神經環路興奮/抑制平衡是維持正常功能的基礎。在感覺皮層中，信息的傳入和傳出主要依賴興奮性神經元，大腦由此感覺到外界刺激，而抑制性中間神經元則對興奮性神經元具有重要的調控作用。最近有報導在Shank3B-/-小鼠的島葉和vS1內發現PV中間神經元環路出現缺陷。因此作者提出假設：Shank3B-/-小鼠中興奮性神經元過度活躍可能是由於抑制性中間神經元受損所致。顯微注射AAV-Dlx5/6-GCaMP6從而選擇性地對vS1的抑制性中間神經元進行雙光子鈣成像。結果顯示，Shank3基因敲除小鼠的感覺皮層中抑制性中間神經元活動降低，而神經元之間的關聯性在對照組和轉基因組中均增加。
隨後按照第二部分的研究方法，觀察外界刺激引發的神經活動。發現在Shank3B-/-小鼠中外界刺激引發的神經元數量顯著下降，並且電活動的幅度也降低。
Step4 特異性地敲除vS1區中間神經元的Shank3
造成中間神經元被抑制進而激活興奮性神經元
錐體神經元高反應性是否是因為中間神經元Shank3缺失造成的？中間神經元活動的下調是否繼發於神經環路發育異常？為了闡明這些問題，作者培育了由Dlx5/6啟動子驅動Cre重組酶表達的條件性敲除鼠（Shank3Bfl/fl），特異性敲除vS1抑制性神經元中的Shank3，並使用單細胞PCR驗證。結果證實所有中間神經元中shank3基因被敲除，而23.15±3.34%的興奮性神經元中shank3被敲除。雙光子鈣成像結果顯示，GABA能中間神經元缺失Shank3後，vS1的第II/III層中間神經元鈣離子活動降低，神經元之間關聯性增加。本文同時觀察了抑制性神經元對外界刺激的反應性。結果顯示，出現反應的抑制性神經元數量下降，反應的幅度也下降。這些結果證明敲除中間神經元中的Shank3會導致vS1的第II/III層中間神經元活性降低。
作者繼續驗證中間神經元活性降低是否會導致興奮性神經元的興奮性增加。在條件敲除vS1抑制性神經元中Shank3的同時，監測興奮性神經元中GCaMP6的活性。條件敲除Shank3後，自發性鈣活動增加，興奮性神經元活性顯著增強，並且神經元之間的關聯性也增加了。對於外界刺激的反應也與Shank3B-/-小鼠中獲得的結果相一致。
這些結果證實，敲除中間神經元的shank3後皮層抑制降低，皮層環路的興奮性增加。
Step5
特異性敲除中間神經元Shank3導致對外界刺激高反應
作者最後觀察了行為學表現的改變：特異性敲除感覺皮層抑制性中間神經元Shank3是否足以引起小鼠觸覺過敏。方法同第一部分，且與第一部分結果相似，敲除中間神經元Shank3的小鼠的感受閾值明顯低於對照組小鼠。
由於在第四部分的研究中證實，敲除中間神經元Shank3的同時，約20%的興奮性神經元中Shank3也被敲除，作者想了解散在和選擇性的敲除shank3對放電率和行為學的影響。作者滴定注射攜帶重組酶的逆轉錄病毒，使40%的興奮性神經元中的Shank3被敲除。結果顯示興奮性神經元中自發以及外界刺激引發的神經活動均下降，伴隨行為學的改變。以上研究結果提示，在部分興奮性神經元中敲除shank3B並不會改變對刺激的敏感性。
作者進一步觀察單純下調抑制性神經元活動是否足以解釋在Shank3B−/−小鼠中觀察到的現象。通過化學遺傳學技術選擇性降低感覺皮層局部中間神經元的活性，觀察到了在Shank3B-/-和條件性敲除小鼠中同樣的神經活動變化和行為學變化。這些結果證明vS1中間神經元Shank3缺失足以導致感覺超敏。
總結
感覺異常在ASD患者中普遍存在，給患者的日常生活帶來了極大的困難。這項研究證實，大腦感覺皮層中間神經元Shank3基因缺失引起的中間神經元活性降低是導致ASD動物模型感覺過敏的關鍵機制，為尋找可能的ASD感覺異常治療策略提供了重要的理論依據。
原始文獻：
Chen Q, Deister CA, Gao X, Guo B, Lynn-Jones T, Chen N, Wells MF, Liu R, Goard MJ, Dimidschstein J et al: Dysfunction of cortical GABAergic neurons leads to sensory hyper-reactivity in a Shank3 mouse model of ASD. Nat Neurosci 2020, 23(4):520-532.
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