前言
2020年10月大連化物所許國旺研究員團隊與上海交通大學附屬第六人民醫院賈偉平教授團隊、中科院上海生命科學研究院吳家睿研究員團隊合作在Advanced Science期刊上發表題為「Multiplatform Metabolomics Reveals Novel Serum Metabolite Biomarkers in Diabetic Retinopathy Subjects」的研究成果。本研究共納入905名受試者的血清樣本，基於多平臺代謝組學數據（GC-MS、LC-MS和LC-MS脂質組），全面地揭示了糖尿病視網膜病變發生發展過程中異常的代謝特徵和紊亂的代謝途徑。通過多變量/單變量統計分析，研究人員發現並驗證了一個新型組合標誌物（12-HETE和2-piperidone），實現了糖尿病視網膜病變的快速、精準的體外診斷。該組合標誌物在疾病的早期診斷中也表現出明顯優勢。該研究為糖尿病視網膜病變血液檢測提供了可靠、高效、便捷的新方法。
中文標題：多平臺代謝組學揭示糖尿病性視網膜病變受試者的新型血清生物標誌物
研究對象：人血清
發表期刊：Advanced Science
影響因子：15.84
發表時間：2020年8月
發表單位：中國科學院大連化學物理研究所
運用生物技術：非靶向代謝組（GC-MS、LC-MS和LC-MS脂質組）
研究背景
糖尿病性視網膜病變（DR）作為糖尿病（DM）最主要的眼部微血管併發症，是DM病人致盲的主要原因之一。國際糖尿病聯盟（2015年）估計，到2030年，DR和威脅視力的糖尿病性視網膜病變（vision-threatening DR）的發病人數將分別增加至191.0和5630萬。DR的篩查和早期診斷在預防和治療該疾病中尤其重要。儘管在臨床中通常使用視網膜成像方法來篩查和診斷DR，並成功降低了視力喪失率，但當前的DR篩查仍然面臨著評估視網膜圖像的主要醫護人員可用性的問題。因此，需要有效的方法以防止疾病發展，如可靠的生物標誌物來篩查DR。在明顯的臨床DR發生之前，可能會發生視網膜血管和神經損傷，並伴有微動脈瘤和滲出液出現在視網膜水腫上。血紅蛋白A1c（HbA1c）是DR病程中唯一經過驗證的全身性生物標誌物；然而，HbA1c僅解釋了6.6％的視網膜病變風險。因此，仍然迫切需要鑑定用於DR篩選或檢測的新型生物標誌物。
這項研究的目的是從多個分析平臺獲取代謝譜數據，以全面闡明與DR發生和發展相關的異常代謝，並進一步確定可靠的血清生物標誌物，以診斷糖尿病人群的DR和早期DR。
研究思路
結果與討論
1、DR代謝及脂質化合物譜圖分析
首先，生成偏最小二乘判別分析（PLS-DA）得分圖，並且置換測試表明模型可靠且無過度擬合（圖1A、B和C）。DR受試者與NDR受試者的明顯分離意味著DR中發生了異常代謝，隨後針對DR和NDR組之間三個平臺鑑定出的代謝物進行了單變量分析。共有348種獨特代謝物（分別來自GC-MSM，LC-MSM和LC-MSL的93種，119種和194種代謝物）符合p <0.05和FDR<0.05的標準，顯示出DR和NDR組之間的顯著性變化（圖1D）。另外，與NDR受試者相比，DR中多種脂質（亞）類（例如，脂肪酸，磷脂和鞘脂）顯著增加（圖1E）。
2、NPDR代謝及脂質化合物譜圖分析
早期DR的檢測對於治療非常重要。因此，招募了早期DR的樣本，即NPDR，以研究代謝組學和脂質組學分布。根據來自GC-MSM（圖1H），LC-MSM（圖1I）和LC-MSL（圖1J）的代謝組學數據，PLS-DA分析表明，NPDR組也明顯與NDR組分離。另外，來自GCMSM，LC-MSM和LC-MSL平臺的總共81、103和156種代謝物在NPDR和NDR組之間存在顯著差異（p <0.05，FDR <0.05，圖1K）。此外，相對於NDR，NPDR中多種脂質（亞）類（例如，脂肪酸，磷脂和鞘脂）的總水平顯示出顯著增加（圖1L）。
圖1 | DR和NDR樣本代謝物整體分布情況
3、不同臨床亞型的DR患者的代謝及脂質化合物分析
在discovery階段，鑑定了NDR，NPDR，MNPDR，SNPDR和PDR不同臨床級別之間的差異代謝物。與NDR組相比，PDR和非PDR（包括NPDR，MNPDR和SNPDR）中的大量代謝物顯著變化。與非PDR組相比，PDR組中的某些代謝物表現出明顯的變化。但是，很少有代謝物在NPDR，MNPDR和SNPDR之間的成對比較中顯示出顯著變化。此外，還觀察到PDR組趨向於接近NDR，這意味著PDR組與其它組（例如NPDR，MNPDR和SNPDR）相比，具有與NDR組更相似的代謝分子特徵。
4、差異代謝通路分析
為了系統地評估DR的代謝紊亂機理，對代謝組學數據進行了代謝通路分析。DR引起的代謝紊亂主要與糖酵解代謝，TCA代謝，尿素循環代謝，多元醇代謝，胺基酸代謝（例如，甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝；牛磺酸和次牛磺酸代謝；精氨酸-脯氨酸代謝；纈氨酸-亮氨酸–異亮氨酸的生物合成）和脂質代謝（例如，磷脂代謝，鞘脂代謝，甘油酯代謝和脂肪酸代謝）有關。
5、發現集中DR的代謝物標記和診斷性能分析
在discovery研究中，DR受試者中12-HETE和2-piperidone（2-哌啶酮）的水平比NDR受試者高得多（圖1F）。基於12-HETE和2-哌啶酮對DR和NDR組進行了二元邏輯回歸分析，新型組合標誌物（2-哌啶酮和12 HETE）（AUC 0.946）的診斷性能在區分DR和NDR方面優於12-HETE（AUC 0.924），2-哌啶酮（AUC 0.882）和HbA1c（AUC 0.691）。此外，新型組合標誌物（0.894和0.919）顯示出比HbA1c（0.657和0.686）更高的敏感性和特異性。
還觀察到，NPDR組的12-HETE和2-哌啶酮水平高於NDR組（圖1M）。在區分NPDR和NDR方面，新型組合標誌物（AUC 0.958）的診斷性能優於12-HETE（AUC 0.923），2-哌啶酮（AUC 0.893）和HbA1c（AUC 0.648）。此外，在區分NPDR和NDR方面，新型組合標誌物顯示出比HbA1c（0.611和0.686）更高的敏感性和特異性（0.929和0.901）。這些結果突出了新型組合標誌物早期診斷潛力。
6、驗證集中DR的代謝物標記和診斷性能分析
為了驗證新型組合標誌物在區分DR或早期DR與NDR方面的診斷性能，進一步研究了444個樣本（包括105個NDR，103個NPDR，103個MNPDR，113個SNPDR和20個PDR樣本）的另一個獨立隊列（驗證集）。基於LC-MS平臺，以MRM對12-HETE和2-哌啶酮進行了定量。
在驗證集中，DR和早期DR的血清12-HETE和2-哌啶酮的濃度要比NDR高得多（圖1G，N）。這些化合物通過用於DR和NPDR檢測的邏輯回歸模型用於構建生物標誌物組。與發現結果相似，新型組合標誌物在區分DR和NPDR與NDR方面表現出比HBA1c更高的診斷性能。在DR和NDR比較組中的相應參數分別為（AUC 0.928，敏感性0.805和特異性0.933）與（AUC 0.555，敏感性0.392和特異性0.760），在NPDR與NDR比較組中的相應參數分別為（AUC 0.925，敏感性0.816和特異性0.933）與（AUC 0.518，敏感性0.327和特異性0.760）。從以上數據可以看出，儘管HbA1c是唯一經過驗證的DR進展的全身生物標誌物，但是它不足以將DR與NDR區分開，相反，本研究新定義的組合標誌物可以實現更好的診斷潛能適用於發現組和驗證組。
7、代謝組學和脂質組學途徑分析
代謝組學提供了對疾病途徑的獨特見解，因為代謝產物是所有生物過程的產物，它們的差異水平反映了環境和遺傳因素之間錯綜複雜的相互作用。本研究使用多種分析平臺（GC-MSM，LC-MSM和LC-MSL）（以涵蓋儘可能多的代謝物）對個體與DR相關的血清代謝物譜變化進行了系統評估。在所描述的348種獨特代謝產物中，發現與DR發病相關的代謝產物比其他研究多得多，涉及與TCA和尿素循環代謝有關的代謝產物，（支鏈）胺基酸，多元醇，核苷酸及其衍生物，肉鹼，膽汁酸和脂質等。此外，使用差異代謝物進行了完整的代謝途徑分析，以探索基於途徑的代謝組學特徵，這些特徵主要與能量代謝，胺基酸代謝和脂質代謝相關（圖2）。
能量代謝在DR的發生和發展中起關鍵作用。糖酵解和TCA循環這兩個主要的能量代謝途徑，引起了作者的注意。研究發現與葡萄糖代謝相關的乳酸在DR患者中顯示出明顯的增加（圖2A）。此外，與NDR相比，DR中檸檬酸，異檸檬酸，琥珀酸，富馬酸和蘋果酸的水平也顯著增加（圖2A），反映了TCA系統增加的可能性。許多研究表明線粒體功能障礙與糖尿病及其併發症密切相關。研究觀察到，相對於NDR，DR的TCA途徑中右側（富馬酸和蘋果酸）代謝物的倍數變化小於左側（檸檬酸，異檸檬酸和琥珀酸）的倍數變化。作者假設右側的中間體用於增強尿素循環，而左側的中間體則通過天冬氨酸代謝得到補充。DR中的天冬氨酸代謝和尿素循環的增加似乎證實了上述假設。但是，詳細的機制有待進一步研究。總體而言，能量代謝增加與DR的發作和進展有關。
研究發現，與NDR相比，DR中大多數胺基酸的含量均顯著增加（圖2A）。DR中高水平的精氨酸，鳥氨酸，瓜氨酸和脯氨酸反映了精氨酸代謝的上調。與許多其他研究一致，精氨酸代謝的增加可能是DR的介體，支鏈胺基酸（BCAA）代謝中亮氨酸，異亮氨酸和纈氨酸的水平也增加了。循環中BCAA的水平升高被認為與視網膜中穀氨酸的強烈神經毒性有關，這在DR神經變性中起重要作用。從根本上講，BCAA通過激活mTOR途徑發揮作用，該靶標在細胞生長，增殖和存活的調節以及VEGF途徑的上調中起作用。VEGF途徑的激活導致Caspase-3表達增加，從而導致視網膜損傷。因此，研究認為應更多地注意循環中胺基酸的水平，這將有助於理解DR的發病機理。
此外，相對於NDR，大多數脂質的水平顯示DR的顯著增加。鞘脂是脂質的必需成分之一。最近研究表明，神經醯胺，鞘氨醇和1鞘氨醇磷酸（S1P）已被確定為具有生物活性的鞘脂，S1P影響血管的形成，分化和內皮細胞遷移。因此，源自磷脂醯膽鹼和鞘脂生物合成增加的高水平鞘脂（圖2B）可能會加劇細胞增殖和血管形成，在DR發病和進展中起著非常重要的作用。
圖2 | DR中代謝途徑的變化
8、生物標誌物確認和驗證
在利用單變量分析進行系統篩選之後，鑑定並驗證了包括2-哌啶酮和12 HETE的新型組合標誌物。在這項研究中，還對NPDR患者的血清代謝物檢測結果進行了早期診斷。該新型組合標誌物在從高危人群（NDR）中分離出DR和早期DR（NPDR）方面表現良好。在發現組和驗證組中，此新型組合標誌物對DR的診斷準確性範圍分別為75.0–92.9％和80.6 -95.0％。
12-HETE是類二十烷酸，是人類12-脂氧合酶（LOX）的主要產物，可在hRECs中誘導內質網（ER）應激。許多研究表明，類二十烷酸代謝紊亂在疾病進展中起著至關重要的作用。本研究發現DR中循環的12-HETE水平逐漸升高，並且與DR的發作和發展呈正相關。許多研究表明12-LOX通過激活ER應激，NADPH氧化酶和VEGFR2信號網絡參與DR中的視網膜微血管失調，並且破壞Ca2 +穩態可能是促進信號通路的必要步驟。
另一種生物標記物2-哌啶酮，是一種在工業上廣泛用於合成聚合物（尼龍5）的單體。然而，迄今為止尚無血清中2-哌啶酮的報導。在本研究中，DR和早期DR中的循環2-哌啶酮水平顯著增加。然而，目前無法通過細胞生物學研究發現2-哌啶酮的相關途徑或生物學功能。因此，作者研究了hRECs中2-哌啶酮的生物學功能，以確定2-哌啶酮是否具有與DR進展相關的生物學功能。
與對照組相比，添加2-哌啶酮的hRECs（濃度≥0.4μg mL1）在24和72 h時存活率顯著提高。超過0.4μgmL-1的2-哌啶酮可促進hREC增殖。與對照組相比，用各種濃度（0.75、1.5、3μgmL-1）的2-哌啶酮處理的hRECs中VEGFA和VEGFR2的相對mRNA表達水平明顯增加。此外，用2-哌啶酮處理的hRECs培養基中VEGF的相對濃度顯著升高。用2-哌啶酮處理的hRECs中VEGFR2的表達也顯著增加。重要的是，在用2-哌啶酮處理的hREC中觀察到明顯的血管形成。這些結果似乎暗示2-哌啶酮能夠促進血管生成。與對照相比，濃度分別為0.75、1.5和3μgmL-1的2-哌啶酮處理的hRECs中，相關基因（例如TNF-α，IL-6，ICAM1和VCAM1）的相對mRNA表達水平顯著增加。根據ICAM1和VCAM1的免疫印跡以及IL-6和TNF-α的相對濃度，在用2-哌啶酮處理的hREC中，觀察到明顯的上調，表明2-哌啶酮與促炎活性密切相關。結果表明，一種新的生物標記物2-哌啶酮，獨立於12-HETE，可以促進hREC增殖，血管生成和炎症，而這些指標與DR的發展密切相關。
實驗結論
綜上所述，本研究突顯了代謝組學研究對於確定DR發病機理的潛在重要性，表明代謝組學分析可有效識別高危人群的DR和早期DR的診斷標記。生物標誌物（2-哌啶酮）具有促進hREC增殖，血管生成和炎症的生物學功能。到目前為止，這是最全面的代謝組學研究，涉及大量人群，研究代謝譜與DR發作和進展之間的關係。這項基於多平臺的代謝組學研究為全面探索複雜的代謝網絡並用於DR血清生物標誌物篩查提供了實用的研究策略。
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本研究對嚴重危害人類健康的糖尿病性視網膜病變展開研究，共納入905名受試者的血清樣本，基於多平臺代謝組學數據，全面地揭示了糖尿病視網膜病變發生發展過程中異常的代謝特徵和紊亂的代謝通路。通過多變量/單變量統計分析，研究人員發現並驗證了一個新型組合標誌物（12-HETE和2-piperidone），實現了糖尿病視網膜病變的快速、精準的體外診斷。這項基於多平臺的代謝組學研究為全面探索複雜的代謝網絡並用於DR血清生物標誌物篩查提供了實用的研究策略。
文末看點
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文章來源於鹿明生物