【蛋白晶片法or質譜法】蛋白質組學研究方法的選擇及比較

2021-02-23 實驗與分析

抗體晶片（antibody array）和質譜（MS）是兩種適用於蛋白質組學研究的流行工具。經常會有人將兩種方法進行比較，科學上很難有一勞永逸的方法，每一種方法都有其優勢和局限，有各自的用武之地。那麼，研究蛋白質組學應該如何選擇更合適的研究方法呢？以下將從六個主要方面進行比較和推薦。

近年來，高通量技術平臺的開發大大推動了蛋白質組學研究工作。這些適用於蛋白質分析和標誌物開發的平臺讓研究人員能夠在單次分析中檢測數千種蛋白質。不過，您可能又會面臨甜蜜的負擔，不知道應該選擇哪個平臺。
在此，我們將介紹兩種適用於蛋白質組學研究的流行工具：抗體晶片（antibody array）和質譜（MS）。這兩種方法可以單獨使用，它們產生的數據可以是定性的、半定量的或定量的；也可結合使用，以提高蛋白質組的覆蓋度。當然，具體使用哪種工具要取決於您想回答的問題。抗體晶片利用固定在固態基質（比如硝酸纖維素膜、載玻片或微珠）上的抗體來捕獲樣品中特定的蛋白質靶點。之後，利用標記的檢測抗體來確認前面兩者的結合，反應所產生的信號與捕獲的分析物的量成正比。
蛋白質的鑑定過程也很簡單。對於抗體晶片，利用spot的位置可判斷蛋白質。至於CBA（流式細胞微球晶片），根據微珠的顏色可以鑑定蛋白質。這些技術的主要優勢在於憑藉出色的抗體靈敏度，它們能夠檢測低豐度的蛋白質。不過，前提是市場上有經過驗證的抗體，並且與抗體晶片平臺兼容。目前，RayBiotech、R&D Systems（Bio-Techne）、CST、BD、Abcam等多家公司提供抗體晶片。若想篩選儘可能多的蛋白質，不妨選擇抗體數量多的晶片，比如RayBiotech的Human L2000 Array包含多達2,000個抗體；若想聚集某一條特定通路，則可以選擇相應的產品。液相色譜串聯質譜（LC-MS）是蛋白質組學研究中最常用到的形式。它首先將蛋白質變性、還原、烷基化和消化，然後對產生的肽段進行分離和離子化。之後根據其質量和片段將每個帶電荷的肽段分配給蛋白質。一次質譜分析可鑑定出5,000多種蛋白質，具體取決於上遊樣本製備和基質。
質譜分析的局限性在於，高豐度的蛋白質可能通過離子抑制而掩蓋低豐度蛋白的檢測。因此，人們有必要事先去除高豐度蛋白，或富集低豐度蛋白。不過，質譜分析是「無假設的」，因為它不依賴於抗體進行檢測，也就無需假設哪些蛋白質是關注的重點。一些人認為，質譜是研究蛋白質組學的經典方法，所以，一說起研究蛋白質，張口閉口都是質譜，調查發現，其實很多人對質譜的了解也是非常片面、有限的，更多的也是互相之間口口相傳。而對於研究蛋白質組學的另一個卓越的方法蛋白晶片的認識，則多數停留在十幾二十年前的水平，普遍認為這種方法在原理上並不複雜但在技術上還是挺難實現的，所以，有人做到了就顯得不太正常，竟然不太相信過去十多年這個行業突飛猛進的發展。
好吧，此處不加評論，還是讓我們言歸正傳。其實，正如世上沒有包治百病的良藥一樣，科學上也很難有一勞永逸的方法，每一種方法都有其優勢和局限，有各自的用武之地。那麼，研究蛋白質組學應該如何選擇更合適的研究方法呢？以下將從六個主要方面進行比較和推薦。

建議選擇：1000個因子的晶片+質譜

1、不同的方法學有不同的特點：對於質譜，可以篩查到未知的蛋白，但是對於分子量大、低豐度的蛋白質，質 譜的靈敏度和準確性有一定的限制。

2、不同的方法能篩查到的目標不同：根據Proteome Analysis of Human Aqueous Humor

一文中報導，質譜篩查到的差異蛋白集中在小分子與代謝物。而用晶片篩查到的結果，多是集中在細胞因子、趨化、血管、生長等等。

3、質譜篩查到355個蛋白，而R抗體晶片也篩查到328個蛋白，且用定量晶片驗證25個蛋白有差異，這些蛋白是質譜找不到的。目前夾心法抗體晶片已經可以檢測到1000個蛋白，採用雙抗夾心法，尤其是對於低豐度蛋白，有很好的靈敏度和特異性，很多的低豐度蛋白是抗體晶片可以檢測出來，而質譜檢測不到的，且樣品不經過變性和前處理，保持天然狀態的樣品直接檢測，對於蛋白的檢測準確度高。

4、質譜的重複性一直是質譜工作者糾結的問題，不同操作者的結果，不同樣品處理條件，峰值的偏移等影響因素都會產生大的影響；夾心法晶片重複性高。

5、質譜一次實驗可以測定8個樣品；抗體晶片一次實驗可以測定2—1600例樣品甚至更多。

建議選擇：抗體晶片

RayBiotech抗體晶片主要包含：炎症、趨化、凋亡、生長、血管、受體、自身抗體、神經疾病、免疫性疾病、粘附，腫瘤，幹細胞、肥胖、骨代謝、胰島素類，白介素TH類、Ig分型，基質金屬蛋白酶，膿毒症，熱休克等晶片。如果盲篩過後小範圍驗證以及根據自己的研究方向確定的篩查範圍，可以從多種晶片中選擇。

建議選擇：抗體晶片

如果樣品是血清血漿，選擇抗體晶片更適合，因為質譜界向來對於血清的檢測效果不看好，血清的成分複雜尤其是50%以上是白蛋白，還有大量的免疫球蛋白、纖維蛋白原，凝血因子和補體，佔血清總蛋白的99%以上，剩餘1%的低豐度蛋白的質譜檢測效果很難達優。

建議選擇：抗體晶片

質譜的特點是定性和半定量，如果定量，也是針對感興趣的靶標定量，並不是所有蛋白都可以定量。所以目前基於雙抗夾心法的定量可達1000種蛋白精準定量，所以篩查和定量同時進行的話，抗體晶片有絕對的優勢。

建議選擇：抗體晶片+質譜

對於一些特殊種屬，建議用抗體晶片+質譜，綜合兩種方法最大的篩選範疇，一些種屬質譜資料庫也不全，可用的信息有限，所以結合多種方法做檢測效果更佳。

建議選擇：抗體晶片

如果初步用了質譜進行盲篩，後續進行小範圍的驗證，用定量抗體晶片或者ELISA，如果想用於臨床，用質譜找到的全新蛋白比較困難且需要後續開發很多相關試劑花費大量時間能完成。如果想要儘快完成醫學轉化和臨床應用，還是要在有現成抗體對的差異因子中篩查。RayBiotech目前是全世界上配對抗體最多的公司，客戶直接用最高通路晶片篩查，後續對應的Elisa都是現成配套的。


（內容來源：生物通 豐信科技 由小析姐整理編輯）


與小析姐交流請添加微信：

18201399725

投稿請發送郵件到

zhaomin@vogel.com.cn 

（歡迎業內人士踴躍投稿，將您的文章分享給大家）

相關焦點

  • Nature:利用比較糖蛋白質組學鑑定出導致蓖麻毒素毒性的新玩家
    2017年9月23日/生物谷BIOON/---雖然在基因組學、代謝組學、蛋白質和脂類研究方面取得了重大進展，但糖基化在蛋白質組水平中仍未得到廣泛的探索。對複雜的糖蛋白質組（glycoproteome）進行分析的技術是有限的。糖蛋白不僅在糖基的數量和位置上存在差別，而且也在每種聚糖（glycan）的組成和結構上存在差別。
  • iTRAQ —— 蛋白質組學研究的利器
    ），轉錄組學(transcriptomics），蛋白組學（Proteinomics）和代謝組學（Metabolomics）等。關於這些方面的問題，基因組學是無法回答的。所以，科學家們又進一步提出了後基因組計劃，蛋白質組（proteome）研究是其中的重中之重。蛋白質組學（Proteomics）是蛋白質（protein）與 基因組學（genomics）兩個詞的組合體，表示「一種基因組所表達的全套蛋白質」，即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質。
  • 新研究為單細胞蛋白質組學定義載體蛋白質組限制
    新研究為單細胞蛋白質組學定義載體蛋白質組限制 作者：小柯機器人 發布時間：2020/12/9 13:30:20 美國南加州大學Christopher M.
  • ...利用磷酸化蛋白質組學闡明阿片類藥物在大腦中激活的信號通路
    蛋白活性圖譜馬克斯-普朗克生物化學研究所主任Matthias Mann及其團隊利用質譜法（一種確定樣品中蛋白的身份和數量的方法）描述了許多器官樣品中成千種蛋白的磷酸化模式，為此，他們發明了一個術語，即磷酸化蛋白質組學（phosphoproteomics）。在最近的一項研究中，他們分析了大腦不同區域中的對阿片類藥物作出反應的信號通路激活。
  • 人類蛋白質組計劃達到重要裡程碑,90%的預測蛋白被檢測到
    這張最新的人類蛋白質組藍圖於近日發表在《Nature Communications》雜誌上，同時也發表在《Journal of Proteome Research》雜誌上。早前，人們預測人類基因組共編碼19,773個蛋白質，研究人員目前已經檢測到17,874個。
  • 蛋白質組學技術及其在中藥複雜體系研究中的應用
    重要小貼士「首期蛋白質組學培訓會議」將於2017年12月8-10日在北京召開，本次培訓班將邀請一線從事蛋白質組學及其在中醫藥領域應用的專家人員，深入講解蛋白質組學分析方法的特點及選擇、數據分析的流程及技巧、SCI論文撰寫
  • 蛋白質組學——iTRAQ技術簡述
    隨著高通量、高靈敏度、高解析度生物質譜技術的出現，蛋白質組學技術取得飛速發展，人們不再滿足於對一個細胞或組織的蛋白質進行定性研究，而是著眼於蛋白質量的研究，於是蛋白質組學概念就被提出，並得到了廣泛的應用。
  • 復旦大學等創建精準N糖蛋白質組學分析方法—新聞—科學網
    科學網9月5日上海訊（記者黃辛）復旦大學化學系教授楊芃原團隊、中科院計算技術研究所研究員賀思敏團隊、國家蛋白質科學中心（上海）研究員黃超蘭團隊合作研究，
  • 實力乾貨—蛋白質組學(iTRAQ)
    現在有一種很火的蛋白定量技術叫做iTRAQ，相信很多接觸過蛋白組學方面研究的童鞋們都有耳聞，不過可能大多數人對它沒有比較深入的了解，現在小知帶領大家一起來好好了解下這種超厲害的定量蛋白質組學技術。隨著生物技術的飛速發展，組學這個詞慢慢的被大家所熟知，包括基因學，轉錄組學，蛋白組和代謝組學等。
  • 《Cell》提出一個新「組學」:蛋白質-代謝小分子互動組學
    同時他們也發現了成千上萬個可以結合代謝物的蛋白位點。目前這一技術已申請了專利。Paola  Picotti科學家們提出了一個新的「組學」——一個處理蛋白質和小分子之間相互作用的互動組學（protein-metabolite  interactomics）。此前系統生物學家專注於基因組學或蛋白質組學，現在他們日益發現了蛋白質-代謝小分子之間相互作用的重要性。
  • Science:對肝臟線粒體功能進行系統蛋白質組學研究
    2016年6月10日/生物谷BIOON/--科學家們通過對小鼠開展大規模蛋白質組學研究獲得脂肪和能量代謝的分子遺傳背景方面的新認識。蛋白質組是一種生物體或某一種細胞、一種組織的基因組所表達的全部蛋白。在一項新的研究中，由瑞士聯邦理工學院教授（ETH Zurich）Ruedi Aebersold領導的一個專門從事蛋白質組學研究的團隊和由瑞士洛桑聯邦理工學院（EPFL）教授Johan Auwerx領導的一個專門從事於線粒體生理學與肝臟疾病研究的團隊合作開展這項突破性的研究項目。就這項研究而言，蛋白質組指的是小鼠肝臟中表達的全部蛋白。
  • 科研乾貨——蛋白組學研究常用資料庫分享
    蛋白質組學產生於20世紀90年代，是以生物體的全部或部分蛋白為研究對象，研究一個生物
  • 質譜「跨界」醫學 妙用蛋白組學分析——訪威斯康星大學麥迪遜分校...
    當前蛋白質組學的質譜分析主要有bottom-up(自下而上)和top-down（自上而下）兩種方法，Bottom-up是傳統的手段，它將蛋白質的大片段混合物消化/酶解成小片段的肽後再進行分析，是在蛋白質組學的研究中廣泛使用的一種質譜技術，但該方式無法取得與PTMs之間相關聯繫的信息。
  • Nature|繪製大腸桿菌的功能性蛋白質組景觀
    質譜法可以觀察整個蛋白質組，當與傳統工具如親和純化或排阻色譜結合時，可以直接檢測蛋白質-蛋白質的相互作用，雖然功能強大，但這些方法是在細胞裂解後進行的，會改變蛋白質原始環境以及結合能力【1,2】。首先，作者對121株大腸桿菌（大多數是來自Keio library的單基因缺失突變體）完成二維熱蛋白質組分析（2D-TPP），利用化學遺傳學數據以選擇突變體來幹擾不同的細胞過程。
  • Seer,蛋白質組學領域的 「Illumina」?
    納米粒子(NP)技術結合自動化儀器和軟體，在蛋白組學的基礎研究和發現、轉化研究、診斷和應用市場具有潛在的應用前景。 一、蛋白質組學行業蛋白質是生命的基石，在一個有機體中執行所有的基本功能。然而，目前的蛋白質組學方法仍然過於複雜，昂貴，或在規模上有限，無法挖掘蛋白質組學的巨大潛力。
  • TMT蛋白質組學與生物信息學分析不同石杉鹼甲含量的蛇足石杉葉狀體的蛋白差異
    方法  利用定量蛋白質組學串聯質譜標籤（tandem mass tag，TMT）技術對不同株系蛇足石杉葉狀體進行定量蛋白質組學檢測和鑑定，再對差異蛋白進行GO和KEGG等生物信息學分析。本研究利用串聯質譜標籤（tandem mass tag，TMT）定量蛋白質組學方法，分析不同Hup A積累能力的蛇足石杉葉狀體的差異表達蛋白，並進行生物信息學分析，篩選與合成生物鹼有關的目的蛋白，結合不同株系的Hup A含量特性關聯分析，揭示HupA生物合成相關的分子信息。
  • 水生所蛋白質翻譯後修飾組學研究獲進展
    蛋白質的翻譯後修飾，如磷酸化、乙醯化等，是調節蛋白質生物學功能的關鍵步驟，是蛋白質動態反應和相互作用的一個重要分子基礎，也是細胞信號網絡調控的重要靶點。由於翻譯後修飾蛋白質在樣本中含量低且動態範圍廣，其研究極具挑戰性。近期，中國科學院水生生物研究所葛峰研究員學科組在蛋白質翻譯後修飾組學及其功能方面展開了深入的研究並取得了系列進展。
  • 蛋白質組學樣本提取指南
    上一期我們總結歸納了蛋白質組學樣本的收集與保存方法，大家學會了嗎？我們辛辛苦苦準備的樣本到了提取的時候不知道選擇哪一種裂解液？
  • SWATH-MS定量蛋白質組學
    SWATH-MS定量蛋白質組學揭示了乳糖酸對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的多靶點抗菌機制熱烈祝賀瀋陽農業大學康教授及其團隊研究成果榮登J. Agric. Food Chem.在這項研究中，作者運用基於SWATH的定量蛋白質組學以及掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）的超微結構觀察，系統的研究了LBA在蛋白質組水平上對MRSA的抗菌機制。進一步通過基於PRM的靶向質譜技術和實時定量PCR（qRT-PCR）技術驗證了幾種差異表達蛋白的蛋白表達水平和mRNA表達水平。
  • IF:12.1跨實驗室比較基於DIA的蛋白質組學質譜工作流程穩定性潛力
    然而僅僅依靠基因組學的數據，無法為臨床決策（clinical decision）提供足夠的支持，其他數據例如蛋白質組學（proteomics) 數據、健康科學（healthcare）數據等依然需要被納入到精準醫學的數據處理之中。