「首期蛋白質組學培訓會議」將於2017年12月8-10日在北京召開，本次培訓班將邀請一線從事蛋白質組學及其在中醫藥領域應用的專家人員，深入講解蛋白質組學分析方法的特點及選擇、數據分析的流程及技巧、SCI論文撰寫等法。了解培訓詳細信息及報名直接點擊文章最下方閱讀原文。
蛋白質組學技術及其在中藥複雜體系研究中的應用
劉 璇, 嶽慶喜, 果德安
（中國科學院上海藥物研究所中藥現代化研究中心, 上海 201203）
中藥是經過大量、 長期中醫臨床的實踐而總結產生的治療方法, 歷經 2 000 多年的臨床應用, 中藥的有效性、實用性和科學性已經毋庸置疑, 中藥可以被稱為是我國傳統文化的寶貴財富。但是, 中藥是典型的複雜物質體系, 其複雜性使對其作用機制的研究非常困難。首先, 中藥的來源具有多樣性,其來源以植物藥為主, 其次是動物藥、礦物藥等。各種來源的原料藥導致中藥中化學成分多種多樣,化合物的多樣性又繼而導致中藥表現出有多個效應器官、多種作用和多個作用靶點。另外, 中藥的臨床應用形式多以複方為主, 複方中多味藥的配伍應用使得中藥的研究更為複雜和困難。複方的研究中既需要研究各單方中各化學成分的生物活性, 又需要研究各單方之間的配伍規律及其協同作用方式等。因此, 中藥複雜體系的作用機制研究中迫切需要應用現代科學發展的新技術和新手段, 探索適合中藥研究的新方法和新模式, 才有可能真正揭示其藥效物質基礎和作用機制, 使其「複雜而可知」。
中藥包括複方的現代化研究一直是中醫藥界多年來關注的焦點和研究的熱點。近年來, 我國政府已經制定了一系列與中藥及其複方現代化研究相關的綱領性文件和全局性規劃。 在 2007 年的《中醫藥創新發展規劃綱要(2006-2020 年)》中明確提出「充分運用中國所具有的中醫、西醫和中西醫結合三支力量共同發展的歷史積累和獨特經驗, 以及現代系統科學與複雜科學等理論和方法, 對中醫藥學蘊含的生命科學問題開展廣泛深入的研究和探索,在豐富和發展中醫藥理論和方法學體系的同時, 爭取在與中醫藥科學內涵相關的若干問題上取得突破」。同一時期, 2007 年 7 月 NATURE 雜誌一篇專門談論中醫藥的文章裡也指出, 「中醫藥要想取得突破性進展, 必須依靠系統生物學技術」。系統生物學(Systems Biology)的概念於 1999 年由 Leroy Hood 提出, 是指對一個生物系統中所有組成成分(基因、 mRNA、蛋白質等)的構成及其在特定條件下這些組分之間的相互關係的研究, 其認識生物的觀點是從局部觀走向整體觀。系統生物學認為生物系統具有「整體、層次、整合、動態」的特點, 生物機體內存在通過層次之間、網絡之間、系統之間的整合和聯繫建立的無數個大小網絡, 而不同網絡之間的信息整合和傳遞使基因或蛋白質產生出最終的生物學功能。系統生物學的技術平臺是各種組學,如基因組學、蛋白質組學、代謝組學、轉錄組學等,正是這些組學技術的發展產生了大量的生物學數據, 在對這些數據的分析(利用生物信息學)中可以獲得對細胞、組織、器官和生物體不同水平的各種分子結構和功能及其相互作用的了解, 並通過計算生物學/生物信息學來描述和預測生物功能、表型和行為。系統生物學應用於中藥研究的研究思路的提出, 為中藥複雜體系的研究提供了嶄新的思路和方法, 成為目前中藥現代化研究的熱點。迄今為止,不少科研工作者都在系統生物學思路指導下開展了對中藥複雜體系的研究。目前, 在基因組測序已經完成即對基因組靜態的鹼基序列已經清楚之後,系統生物學已經進入了後基因時代, 蛋白質組學等基因功能學的研究成為系統生物學研究的重點。以下重點介紹蛋白質組學的主要研究內容、研究技術及其在中藥複雜體系研究中的應用。
蛋白質組學(proteomics)研究可以稱為是生命科學研究進入後基因組時代的裡程碑, 同時也是功能基因組時代生命科學研究的核心內容之一。蛋白質 組 (proteome) 這 一 概 念 最 早 是 由 澳 大 利 亞Macquarie 大學的 Wilkins 和 Williams 學者在 1994年第一屆義大利錫耶納蛋白質會議上提出，並在1996 年發表了相關綜述。蛋白質組(proteome)是指在一種細胞、組織或生物體中的完整基因組所對應的全套蛋白質, 而蛋白質組學(proteomics)就相應是指研究細胞、組織或生物體蛋白質組的組成及其變化規律的科學。
1.1 蛋白質組學的研究內容
蛋白質組學的研究內容包括表達蛋白質組學、結構蛋白質組學、比較蛋白質組學和功能蛋白質組學四方面的內容。 (1) 表達蛋白質組學是指採用高通量的蛋白質組研究技術分離鑑定某一細胞、組織或完整生物體內儘可能多以至於接近全部的蛋白質, 建立完整的蛋白質組表達譜以及相關的蛋白質資料庫。表達蛋白質組學是從大規模、系統性的角度來研究蛋白質組學, 這也更加符合蛋白質組學研究的本質; 但是由於蛋白質的表達隨著時間和空間不斷變化, 要徹底分析生物體內所有的蛋白質將是一個難以實現的目標。 (2) 結構蛋白質組學是指對通過表達蛋白質組學得到的全部蛋白質進行三維結構的精確測定。 (3) 比較蛋白質組學是採用蛋白質組學整體分析技術, 針對不同時間和空間動態變化的蛋白質組進行比較, 分析不同處理組之間蛋白質組在表達水平、表達數量和修飾狀態的差異。通過比較蛋白質組學的方法考察不同時期不同環境下細胞內蛋白質組成的變化, 繼而發現並研究差異表達的蛋白質及其功能, 不僅可以了解疾病的發病機制, 尋找到與疾病診斷相關的特異性蛋白質和藥物治療相關的蛋白質靶點, 而且也可以揭示物理、化學和生物因素幹擾疾病發生的分子機制。在藥物包括中藥的作用機制研究中, 應用最多的就是比較蛋白質組學的方法。 (4) 功能蛋白質組學研究主要包括蛋白質修飾狀態(如磷酸化、糖基化、泛素化、乙醯基化等)、細胞內蛋白質與蛋白質相互作用以及蛋白質表達後在細胞內定位等的研究, 從而構建細胞內蛋白質間相互作用的圖譜以及複雜的信號傳遞網絡。隨著蛋白質組學的發展, 其研究內容日益細化。例如, 蛋白質磷酸化是最重要的也是最常見的一種蛋白質翻譯後修飾方式, 在哺乳動物細胞生命周期中, 大約有 1/3 蛋白質發生過磷酸化修飾。運用蛋白質組學的理論和分析方法研究蛋白質的磷酸化修飾, 可以從整體上觀察細胞或組織中蛋白質磷酸化修飾的狀態及其變化, 由此衍生出磷酸化蛋白組學(phosphoproteomics)這一新研究領域。
1.2 蛋白質組學的主要研究技術
蛋白質組學研究的基本技術包括： (1) 蛋白質組樣品的製備; (2) 蛋白質組樣品的分離; (3) 蛋白質的生物質譜鑑定; (4) 蛋白質空間結構的鑑定。
1.2.1 蛋白質組學樣品製備
蛋白質組學樣品製備的要求是儘可能完整地將所有蛋白質從細胞或者組織中提取出來, 是蛋白質組學研究的首要步驟。常用樣品來源有體外培養細胞、活體組織標本、血清和體液等。使用體外培養細胞的優點是能夠對特定的細胞組分或者亞組分進行分析, 不足之處在於培養細胞不能完全反映體內的真實情況, 且受實驗條件等因素影響, 研究結果存在偏差。從活體組織標本中提取細胞蛋白,應避免血管組織、血細胞、周圍結締組織和間質等的汙染。如果需要進行組織中單類細胞的分離, 可採用機械方法、免疫磁珠、螢光標記細胞分選或近來發展較快的且被普遍看好的雷射捕獲微切割技術(1aser capture microdissection)方法進行。從複合組織中特異性分離出特定的單一細胞或細胞群體, 這樣可以避免組織異質性其他蛋白質成分對於目標蛋白質分析的幹擾和影響, 確保研究結果的可靠性。用於蛋白質組學研究的蛋白質樣品通常可採用細胞或組織中的全蛋白質組分, 也可以進行樣品預分級, 即採用差速離心和密度梯度離心等方法根據蛋白質溶解性和蛋白質在細胞中不同的細胞器定位進行分級, 如可分離出細胞膜、細胞核、線粒體或高爾基體等細胞器的蛋白質成分。其他預分方法還有如用親和層析的方法對有磷酸化修飾的蛋白質進行富集, 只進行磷酸化蛋白的研究等。
1.2.2 蛋白質組樣品的分離
蛋白質組學分離技術主要包括基於蛋白質的分離(以雙向電泳為例)和基於肽的分離(以先酶解後再進行液相色譜分離為例)兩大類。
(1) 雙向凝膠電泳(two-dimensional electrophoresis, 簡稱 2-DE) 技術 O』Farrell 等於 1975年首先創立, 其原理是根據不同蛋白質之間的等電點和分子量差異而分離蛋白質的。其中第一向蛋白質水平電泳是根據蛋白質的等電點不同, 在高壓電場下進行等電聚焦電泳(isoelectric focusing, IEF);第二向蛋白質垂直電泳則是常規的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE), 是根據蛋白質分子量大小的差異導致電泳遷移率的不同而達到分離蛋白質的目的。雙向電泳的凝膠經過考染或者銀染後, 一般一張雙向凝膠上可出現數百至上千個蛋白質點。由於雙向電泳對於蛋白質的分離結果直觀, 也便於計算機進行圖像軟體分析處理, 並能與質譜分析鑑定方法相匹配等優點, 因此雙向凝膠電泳至今仍是目前最常用、最經典的蛋白質分離技術。不過, 雙向電泳也有些不足之處, 例如對靠近 IPG 膠條極端酸性或鹼性蛋白質、部分不溶於樣品緩衝液的膜蛋白、低豐度蛋白質、疏水性蛋白質和相對分子質量特大(>200000)或特小(<8000)蛋白的分離仍有一定的困難; 電泳結果需要染色處理,此項操作費時、費力; 同時, 雙向電泳凝膠的蛋白質載樣量有限再加上不同的蛋白質與染料的結合差異較大會影響一些低表達蛋白質的分離; 此外,該技術尚不能與質譜直接聯用從而難以實現完全自動化。值得一提的是, 近 10 年來, 通用(GE)公司在傳統雙向電泳基礎上開發的一種新型的高靈敏度螢光染料標記的雙向電泳技術即凝膠內差別電泳(differential in gel electrophoresis, DIGE)技術逐漸獲得廣泛的接受和應用。該技術最大的特點是在分析中引入了內參, 通過將不同蛋白質樣品(包括目標蛋白質樣品和對照蛋白質樣品)標記上不同的螢光, 將不同蛋白質樣品在同一塊電泳膠內分離,消除了膠與膠之間的差異, 避免了在使用不同凝膠操作過程中的人為性和偶然性, 從而使獲得的結果更為可信; 並且減少了需要進行電泳的次數, 縮短了實驗需要花費的時間。
(2) 蛋白質組分離技術 目前最常用的也是最有發展前景的，就是酶解後用多維液相色譜技術進行分離。單一的液相分離技術由於自身分離能力的限制, 常常不能滿足蛋白質複合物分離的需要。多維液相色譜法是指兩種或兩種以上具有不同原理特性的液相分離方法的優化和組合, 該技術最突出的優點是對全蛋白質組分進行分析時歧視效應大大減小, 並能與質譜直接聯用, 從而可以實現蛋白質分離與鑑定的在線聯用與操作, 有利於蛋白質組研究的高通量化和自動化。多維液相色譜分離技術主要包括離子交換色譜與反相液相色譜聯用分離技術、雜交相色譜分離技術、其它混雜的二維色譜技術和三維色譜技術等。 1)目前最常用於蛋白質組學分離的多維液相色譜技術是離子交換色譜與反相液相色譜的聯合使用(Ion-exchange chromatography–RPLC, IEX–RPLC)。離子交換色譜技術是通過溶質在離子交換色譜固定相上具有不同的保留能力從而實現對樣品分離的色譜技術。就蛋白質和多肽樣品而言, 其表面帶有的電荷與離子交換色譜固定相表面的電荷發生不同的靜電相互作用, 利用這種相互作用的差異從而實現對蛋白質或多肽混合物的分離; 而反相液相色譜技術則是根據溶質疏水性的差異分離蛋白質或多肽混合物。通過這兩種色譜模式的有效聯合使用, 可以實現對複雜蛋白質組份的二維分離。 IEX–RPLC 的優勢是通過 IEF可以得到很高的樣品容量而 RPLC 與質譜之間有極好的兼容性。 當然, IEX–RPLC 也有缺點, 那就是分離過程需要花費較長的時間, 完成整個分離的過程可能需要幾天的時間。 2) 雜交相色譜分離技術(Hybrid-phase chromatography separations)是應用一前一後的陰離子或陽離子交換柱快速的將等電點範圍寬泛的蛋白質或多肽樣品分離為帶正電荷、負電荷和不帶電荷三部分, 從而有利於樣品的檢測。3 )其他混雜的二維色譜技術 ( M i s c el l a n e o u s two-dimensional chromatography techniques)是用其它的液相色譜分離系統如分子大小排阻色譜(size exclusion chromatography, SEC)或靜態金屬親合色譜(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)與 RPLC 耦聯, 前者已經被成功的應用於酵母、疫球蛋白融合蛋白和細胞色素 b6f 複合體蛋白質組的分析, 後者也被報導成功地改善了對蛋白質磷酸化位點的識別和鑑定。 4 ) 三維色譜技術(Three-dimensional chromatography techniques)是指對那些用二維色譜不能充分分離的複雜樣品, 先用另外一種色譜技術進行預先分離, 例如有報導用SEC 預分離後再用陽離子交換色譜(strong cation exchange)串聯 RPLC 進行人肝組織蛋白質組的分離。
1.2.3 蛋白質的生物質譜鑑定
如果說在蛋白質的分離中各種技術方法是並存的, 那麼在蛋白質的鑑定中, 質譜作為主流技術的地位已無可爭議, 質譜已經成為最常用的蛋白質鑑定技術。質譜技術早在 20 世紀初就已經出現,但當時一直應用於有機小分子領域, 直到 20 世紀80 年代質譜技術才漸漸進入生物大分子領域。隨著20 多年來的發展和應用, 質譜技術逐步取代傳統的胺基酸組成分析和 Edman降解測序, 成為蛋白質鑑定的主流技術、核心技術和支撐技術。質譜技術的基本原理是將蛋白質樣品先經過離子化後, 然後根據不同離子間質子與電荷之比(m/z)的差異來分離並確定蛋白質的分子質量。因此, 用於蛋白質鑑定的各種質譜儀均由樣品離子化裝置、離子檢測器以及質量分析器 3 個最基本的部分組成。
樣品離子化裝置採用典型的「軟電離」的方式電離蛋白質樣品分子。所謂「軟電離」是指在蛋白質樣品分子電離這一過程中, 由於沒有直接的外界能量作用於樣品分子, 所以對樣品分子結構破壞較少,從而保留整個蛋白質分子的完整性, 不會形成碎片離子。蛋白質樣品分子「軟電離」常用的兩種離子化方法是基質輔助雷射解吸離子化(MALDI)和電噴霧離子化(ESI)以及由它衍生出的納電噴霧離子化(nano-ESI)。
(1) 基質輔助雷射解吸離子化 (MALDI) 是指利用固體基質分子均勻地包埋蛋白質樣品分子, 在雷射的照射下, 基質分子吸收雷射能量而蒸發, 從而攜帶蛋白質樣品分子進入氣相, 基質分子進一步將能量傳遞給樣品分子, 從而實現樣品分子的離子化。 MALDI 比 ESI 具有更寬的蛋白質或者多肽的質量分析範圍和更高的鹽離子的耐受性。
(2)電噴霧離子化(ESI) 是指將待測蛋白質樣品溶解在溶劑中, 以液相方式通過毛細管到達噴口,蛋白質樣品分子在噴口高電壓的作用下形成帶電荷的微滴, 隨著微滴中揮發性溶劑的蒸發, 微滴表面的電場隨半徑減小而增加, 當到達某一臨界點時,蛋白質樣品分子以離子方式從液滴表面蒸發進入氣相, 進而實現樣品分子的離子化。 ESI 最主要的優點是它可以比較容易的耦聯在線的分離方法; 此外, ESI 能夠產生帶有多電荷的離子, 通過比較低的質荷比界限實現對於多電荷的離子進行鑑定。
目前最常用的質量分析器包括傅立葉變換離子迴旋共振質譜 (FTICR/FT)、線性離子阱質譜(LIT/LTQ)、四級杆離子阱質譜(QIT)和飛行時間質譜(TOF)4 種。例如, 配有基質輔助雷射解析/電離的飛行時間質譜(MALDI-TOF)非常適用於鑑定 2-DE分離的蛋白點, 其原理是通過利用基質吸收雷射的能量從而使固相的蛋白質樣品分子離子化, 在電場作用下加速飛過飛行管道, 進入質量分析器的離子化肽段因為質荷比(m/z)的差異而發生分離, 樣品質荷比(m/z)與飛行時間呈正比, 根據到達檢測器的飛行時間不同而達到檢測目的。通過測量肽段離子的相關參數, 可以獲得蛋白質樣品分子肽質量指紋(PMF)、肽序列標籤(PST)或部分胺基酸序列等相關信息, 然後通過適當的軟體搜尋相關的基因組和蛋白質組資料庫，實現對蛋白質分子的定性鑑定。該方法操作簡單、高效、快速, 其最大的優點在於離子電荷通常為 1~2 個, 而不是多電荷離子, 這對於分子質量較大的樣品而言, 不會形成複雜的多電荷圖, 有利對圖譜清楚的解析, 適用於高通量大樣本的蛋白質組的篩選與分析。此外, 該技術對於樣品中雜質的容忍程度已相對較好, 排除了因鹽類物質以及組織不純等影響蛋白質樣品分子解吸效率不穩定的因素。但該技術對小分子量蛋白質(特別是相對分子質量<50 000)檢測效果較差, 鑑定到的蛋白質分子量覆蓋度明顯小於其他定量蛋白質組學技術。因此, 鑑於不同質量分析器在物理原理和分析性能方面有不同的特點, 通過重組不同性能的質量分析器, 可以獲得 Q-Q-Q、 Q-Q-LIT、 Q-TOF、TOF-TOF 和 LTQ-FTICR 等多種「雜交」型的質譜。近年來 Thermo Fisher 公司生產的新型雜交型質譜 LTQ–Orbitrap 是目前生物質譜研究領域最優秀的儀器之一。
1.2.4 蛋白質的空間結構鑑定
蛋白質空間結構的研究對於深入理解蛋白質功能與機理非常重要, 同時也是基於結構進行合理化藥物研發及設計的基礎。在國際上, 美國首先提出大規模測定蛋白質結構的計劃, 現在已進入第二期的產出階段, 其他發達國家(歐盟和日本)也相繼啟動了自己的結構基因組計劃。當前國際發展趨勢是以 X射線衍射作為解析蛋白質原子解析度結構的主要手段, 核磁共振技術(NMR)和電鏡技術(EM) 及其他新興技術為輔助手段。
(1) X 射線晶體學技術 自 1895 年德國物理學家倫琴首次發現 X 射線以來, X 射線的應用越來越廣泛。作為其重要分支之一的 X 射線晶體學技術,在解析許多無機及有機化合物空間結構中被廣泛應用。在蛋白質結構解析中的應用最早是由佩如茲(Max Ferdinand Perutz)和坎德魯(John Kendrew)應用該技術分別在 1957 年和 1959 年解析得到了肌紅蛋白和血紅蛋白的三維結構, 第一次準確測定出蛋白質這種生物大分子的三維結構。在隨後的 30 多年裡, 蛋白質晶體學穩健發展, 方法學趨於成熟,主要的儀器設備以及計算機軟體都已市場化, 解析的蛋白質結構數目也逐年增長, 尤其是近幾年來,隨著各國結構基因組學的啟動, 蛋白質晶體學各相關技術領域都得到突飛猛進的發展, 大大加速了大分子晶體結構解析的速度, 使得解析的蛋白質結構數目呈指數形式增長, 到 2007 年 7 月, PDB 庫中的蛋白質結構數近 45 000 個, 其中 80%以上是由 X 射線晶體學方法解析得到的。 X 射線晶體學的關鍵是得到高質量的蛋白質晶體, 將晶體進行 X 射線衍射, 收集衍射圖譜, 通過一系列的計算(晶體結構解析), 就可以得到蛋白質的原子結構。這種方法的優點是：速度快, 且不受大小限制, 無論是多大的蛋白, 或者蛋白與其他化合物的複合體, 只要能夠結晶就能夠得到其原子結構, 然而獲得高質量的晶體卻是一個並不容易突破的瓶頸。
(2) NMR 技術 NMR 用於蛋白質結構的分析是在上世紀 90 年代才成熟並發展起來的。簡單的說, NMR 是指處於一個靜磁場中的核子(質子和中子), 會由於磁場的作用而處於不同的能量狀態, 當一個外界的擺動的磁場來擾動處於「平衡」狀態的核子時, 吸收了能量的核子就會從不同的能級之間躍遷, 並在此過程中會釋放出能量。而放出的能量被檢測到之後, 經過分析和計算就可以得到蛋白質內部的原子的結構信息。它用於蛋白質結構分析的優點是：蛋白質處於溶液狀態; 適合研究蛋白質-蛋白質, 蛋白質-核酸, 蛋白質-配基相互作用; 可研究蛋白質分子內部運動; 也可研究膜蛋白。但是對蛋白的要求也較高：需要毫克量級的蛋白質; 要求溶解度大、高純度、無聚集、足夠穩定的蛋白質;適合於分析較小的蛋白, 對於較大的蛋白質(大於30 KDa)則一般需要 15N 標記或 13C、15N 雙標記, 甚至 2H、 13C、 15N 叄標記。
(3) 電鏡技術 低溫冷凍電鏡(cryo-EM)作為一種新興的技術, 目前的應用還非常少, 並且比較狹窄。快速冷凍的樣品製備方法與傳統的乾燥方法不同, 主要優點是生物樣品可以保持在含水的狀態下,因而更接近天然的生理狀態。快速冷凍可以避免冰晶的形成, 使生物大分子的結構不被破壞。冷凍速度在毫秒量級, 可以用來觀察瞬時過程。測定多亞基蛋白質聚合體的三維結構的電鏡方法主要有二維晶體的三維重構法和單粒子法。結構解析度有時可以達到 0.4 nm, 它們的計算方法一般比較複雜。電鏡法可以與來自晶體或 NMR 的原子結構結合,構建龐大生物分子的高解析度結構, 這一方法近年來在結構生物學中的應用備受關注。
(4) 其他 隨著單分子技術如螢光共振能量轉移(FRET)、原子力顯微鏡(AFM)、單分子操作、螢光光譜、拉曼光譜和快速光譜等的出現和發展, 這些技術在大分子物質尤其是蛋白質的構象分析中的應用也日益成熟。單分子探測的優點是避免了系綜平均、時間或空間的平均, 可以直接觀測單分子的漲落現象。通過建模分析構象的漲落和概率分布,可以構建或勾畫出系統的勢景(energy land-scape)函數。系統的概率分布應有一定的特徵, 它們與系統的特定狀態有關, 由此可以計算某些事件的概率或速率, 如反應速率。由於構象變化可以實時觀測,反應過程的多個途徑的隨機選取可以被記錄下來。這對理解反應的機理和動力學非常重要。所以, 這種方法剛好彌補了晶體學靜態結構的缺陷, 因而成為晶體衍射法的一種良好的補充。
1.3 蛋白質組學與生物信息學的結合
值得一提的是, 在基因組學的發展過程中, 基因組學和生物信息學的結合為科研工作者獲得了很多非常有價值的研究成果。與之相似, 蛋白質組學與生物信息學的結合也是蛋白質組學發展的必需要求。生物信息學是生物學與信息科學、數學、計算機科學等學科相互交叉而形成的一門新興學科。生物信息學是通過採集、處理、儲存、分析和解釋由各種技術平臺(如大規模 DNA 測序、蛋白質組研究等)產生的海量數據, 來闡明和理解這些數據所包含的生物學意義。生物信息學在蛋白質組學中的應用基本包括以下方面： (1) 蛋白質組學資料庫的建立和使用。例如可以建立並使用各種蛋白質的一級結構序列資料庫、空間結構資料庫、蛋白質雙向電泳圖像資料庫、信號傳導及蛋白質一蛋白質相互作用資料庫、 DNA 和蛋白質相互作用資料庫等等; (2) 蛋白質未知結構的預測。例如, 可以根據蛋白質的一級序列數據預測蛋白質的高級結構, 主要是根據同源系列的比對和某些關鍵的胺基酸殘基的位置, 以已知三維結構和二級結構的蛋白質為依據, 預測未知空間結構的蛋白質的二級結構和高級結構; (3) 蛋白質未知功能的預測。 生物信息學最常用的分析方法是模式識別, 即利用存在於蛋白質序列結構中的某些特殊的特徵模體來識別標誌性的序列或者結構, 以此建立模式, 然後在已經建立好的已知蛋白質資料庫中, 搜集與此相似的模式,來確定未知蛋白質的歸屬, 從而預測它的功能。比較的方法包括基於序列相似性比較、基於系統發育譜比較、基於結構域融合比較、基於 mRNA 表達類型的比較等。
由於各種疾病的發生和藥物治療靶點大多數是在蛋白質(酶、受體及信號轉導蛋白)水平, 因此蛋白質組學非常適用於研究藥物的作用機制、尋找有效的藥物靶點及開發新藥。蛋白質組學(結合生物信息學)在中藥複雜體系的研究中至少可以有如下幾方面的用途： (1) 通過比較正常狀態和疾病狀態及藥物(中藥中的單體化合物或有效部位或複方提取物)治療後蛋白質組表達的差異, 尋找藥物的靶點相關蛋白; (2) 用生物信息學方法預測中藥中單體化合物的可能直接蛋白質靶點, 並用蛋白質和化合物相互作用的相關驗證方法(例如表面等離子體共振技術、化合物與蛋白質共結晶後進行 X 射線衍射等)進行驗證; (3) 利用蛋白質-蛋白質相互作用資料庫和中藥的可能作用靶點繪製出中藥的可能作用網絡, 並用生物學方法進行驗證; (4) 對於中藥複方的研究, 可以分析複方中各單方的可能作用靶點, 利用信號通路資料庫等推測各單方之間的可能相互作用, 探索複方的可能配伍機理。
2.1 中藥可能靶點相關蛋白質的尋找
通過比較對照細胞或動物組織的蛋白質表達譜和給予中藥後蛋白質表達譜的差異, 可以找到中藥的可能靶點相關蛋白質。目前, 這個方法已經在中藥的研究中較廣泛地應用, 目前蛋白質組學在中藥研究中的應用實例大部分屬於此類。該方法已被用於中藥中單體化合物、有效部位及提取物的作用機制的研究。
2.1.1 中藥單體化合物的靶點相關蛋白質研究
2003 年 MacKeigan JP 等通過蛋白質雙向電泳分離與質譜鑑定相結合的技術, 發現紅豆杉中分離的單體化合物紫杉醇(paclitaxel/taxol)和 MEK 抑制劑 合 用 時 改 變 了 RNA-binding regulatory subunit/DJ-1 PARK7)蛋白和 Rho GDP-dissociation inhibitor alpha 蛋白的表達。 2004 年 Wenzel U 等發現黃酮類化合物槲皮素(quercetin)通過促進結腸癌細胞株 HT-29 細胞凋亡和分化從而抑制腫瘤細胞的增殖, 並通過蛋白質組學手段鑑定到其影響的一系列蛋白質。2005 年 Lee KH 等利用蛋白質組學的方法研究了紫杉醇在人宮頸癌細胞株 HeLa 細胞中的可能靶點相關蛋白質。 2006 年 Ha WY 等通過蛋白質組學技術闡明從遠志科植物烏棒子(Polygala caudata)中分離的單體化合物 euxanthone誘導小鼠成神經細胞瘤 2a 細胞分化的分子機制可能是與被激活的轉錄因子 E2F transcription factor 5等有關。 2006 年 Chen DM 等利用蛋白質組學的方 法 考 察 了 芍 藥 的 主 要 化 學 成 分 芍 藥 苷(paeoniflorin)能延遲對於局部缺血性中風病理模型大鼠神經保護的分子機制。 2006 年 Wang Y 等利用蛋白質組學技術研究從湖北黃精提取的薯蕷素(dioscin)對人髓系白血病細胞株 HL-60 細胞的細胞毒性的分子作用機制, 2007 年 Wang Y 等進一步通過蛋白質組學技術研究 HL-60 細胞微粒體部分蛋白質組表達的變化, 闡明薯蕷素(dioscin)通過觸發線粒體氧化應急反應, 從而誘導 HL-60 細胞的凋亡。 2008 年筆者所在實驗室 Yue QX 等用蛋白質雙向電泳結合 MALDI MS/MS 質譜鑑定的方法研究了從中藥靈芝中分離的單體化合物靈芝酸 D(ganoderic acid D)對於人宮頸癌細胞株 HeLa 細胞毒性的作用機制, 發現了可能是靈芝酸 D 靶點相關蛋白的 21 個差異表達蛋白。 2009 年 Wang X 等利用蛋白質組學方法發現從藤黃中分離的 S 型藤黃酸(S-gambogic acid)抑制人肝癌細胞株 HepG2 細胞
增殖的蛋白質分子靶標為 stathmin 1 。
2.2.2 中藥有效部位的靶點相關蛋白質研究
2008 年 Cheng ZX 等分析了從中藥重樓(Rhizoma Paridis)中分離的總皂苷有效部位作用於人肝癌細胞株 HepG2 細胞 48 h 後蛋白質組的表達變化。2008 年筆者所在實驗室 Ma C 等通過蛋白質雙向電泳結合質譜鑑定的方法找到了 12 個可能與靈芝孢子總多糖(polysaccharides)刺激小鼠脾臟單核細胞增殖作用相關的蛋白質; 筆者所在實驗室 Yao Y 等分別考察了三七總皂苷和丹參總酚酸抗血小板聚集作用的可能靶點相關蛋白質, 找到了三七總皂苷影響的與血小板聚集、氧化應急反應以及細胞骨架相關的蛋白質和丹參總酚酸影響的與鈣動態平衡、抗氧化以及細胞骨架結構相關的蛋白質。筆者所在實驗室 Yue QX 等通過蛋白質雙向電泳結合蛋白質功能驗證等技術闡明了靈芝總三萜(Ganoderma triterpenes)與抗腫瘤化學藥物阿黴素合用對人宮頸癌細胞株 HeLa 的細胞毒性的分子機制, 其協同作用機制可能是通過增加氧自由基損傷和 DNA 損傷以及誘導細胞凋亡殺死腫瘤細胞。筆者所在實驗室 Ma C 等還考察了多種處理組(對照、環磷醯胺處理、靈芝孢子多糖處理和環磷醯胺加靈芝孢子多糖處理)的小鼠的胸腺組織蛋白質表達譜, 找到了 15 個可能與環磷醯胺的免疫抑制作用相關的蛋白質; 在這 15 個蛋白質中, 其中 6個蛋白質在環磷醯胺誘導下的表達改變可以被合用靈芝孢子多糖所逆轉, 這些蛋白質可能與靈芝多糖對抗環磷醯胺免疫抑制的能力有關。
2.2.3 中藥提取物的靶點相關蛋白質研究
蛋白質組學在中藥提取物(包括複方的提取物)的作用機制研究中也起到了重要的作用。例如, 由熟地黃、當歸、白芍和川芎 4 味中藥藥材組成的四物湯是臨床常用的經典補血名方, 近年來應用蛋白質組學方法在研究四物湯對血虛證動物和血虛證患者的作用機制方面取得了較大的進展。 (1) 2004年 Guo P 等研究了四物湯對於放射線照射後導致的血虛證小鼠骨髓蛋白質表達譜的影響, 發現四物湯能調節骨髓組織糖代謝, 促進造血生長因子信號轉導和造血細胞的生長和分化, 可能由此發揮補血作用, 進而能逆轉放射導致的血虛證。 (2) 2006 年Liu LL 等研究四物湯對於化學藥物環磷醯胺損傷導致的血虛證小鼠骨髓蛋白質組的影響, 結果發現四物湯可能通過影響與細胞凋亡、造血幹祖細胞增殖分化有關的蛋白質而促進骨髓造血。 (3) 2008年 Yang MH 等運用蛋白質組學技術考察了四物湯對於血虛證患者血清蛋白的影響, 結果發現四物湯可能是通過增強免疫、減輕基因損傷、增加血紅蛋白等途徑治療血虛證。蛋白質組學在其他中藥提取物的作用機制研究中的應用還有如 2006 年 WuH等利用蛋白質組學和免疫印跡等技術闡明臺灣民間真菌藥材樟芝(Antrodia camphorata)乙醇提取物抑制非小細胞肺癌細胞株 A549 細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡的分子機制可能與誘發內質網應急反應、進而引起 5 個與腫瘤相關的蛋白質的表達量發生改變有關。 2008 年 Wang CY 等通過基因晶片和蛋白質雙向電泳等方法研究臺灣民間藥材狹葉紫錐菊(echinacea purpurea)丁醇提取物作用於樹突狀細胞引起的基因組學和蛋白質組學的變化, 蛋白質組學的結果表明 12 h 後被處理細胞內與細胞骨架和抗氧化應急相關的蛋白質表達量上調。 2009年 Nquyen-Khuong T 等考察由中藥五味子、大豆、栝樓和西地格絲蘭提取物組成的混合物 MINA-05作用於人膀胱癌細胞 72 h 後蛋白質組的表達變化,鑑定了多種與細胞骨架、能量代謝、蛋白質降解以及腫瘤抑制相關的蛋白質, 提示 MINA-05 抑制膀胱癌細胞增殖是與腫瘤細胞周期、代謝、蛋白質降解以及生存環境的改變相關。 2009 年 Lee TY 等考察由茵陳蒿、梔子和大黃等中藥組成的複方茵陳蒿湯(Yin-Chen-Hao-Tang) 作用於肝纖維化的大鼠膽管結紮模型 27 d 後肝臟蛋白質組的表達變化, 結果發現茵陳蒿湯治療大鼠肝纖維化的作用可能與抑制正常肝細胞的凋亡以及調控脂類物質的生物合成有關。
2.3 中藥直接結合蛋白質靶點的預測和驗證
蛋白質空間結構資料庫的日益完善使得用生物信息學方法預測能與化合物直接結合的蛋白質靶點成為可能。常用的蛋白質空間結構資料庫有CATH、 PDB、 SCOP、 MMDB、 ISSD 等。其中。PDB(protein data bank)資料庫是目前最為詳盡的蛋白質結構資料庫, 它收錄由 X 射線晶體衍射和核磁共 振 得 到 的 三 維 結 構 數 據 , 其 網 址 為http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do。在已知蛋白質空間結構的基礎上 , 可以用反向對接 (inverse docking)-即用小分子配體搜索潛在的結合蛋白的方法預測化合物的可能作用靶點。例如, 筆者所在實驗室與上海生物信息學研究中心合作, 用一種叫 INVDOCK 的反向對接軟體尋找能夠與靈芝酸 D直接結合的蛋白質靶點。 結果表明 14-3-3 蛋白可能是靈芝酸 D 能夠直接結合的蛋白質靶點。對於生物信息學預測的直接作用蛋白質靶點, 還需要用生物學方法進行驗證。筆者所在實驗室採用體外表面等離子體共振技術(Surface Plasmon Resonance/SPR)分析方法用 BIAcore 3000儀器對靈芝酸 D 和 14-3-3蛋白的結合能力進行了驗證。表面等離子體子共振是一種物理光學現象。利用金屬薄膜表面的折射率的改變, 引起共振角的變化, 可以來推斷金屬薄膜表面的變化。具體實驗時是先將目的蛋白質固定在鍍有金膜的傳感器晶片表面, 將可能與之相互作用的化合物分子溶於溶液流過晶片表面。檢測器能跟蹤檢測溶液中的化合物分子與晶片表面蛋白質分子的結合、解離整個過程的變化。除了表面等離子體共振技術外, 還有很多其他的驗證蛋白質和化合物相互作用的方法。例如, 可以製備化合物與蛋白質的共結晶再進行 X射線衍射確定結合的具體位點; 隨後再定點突變蛋白質結合位點的序列, 考察是否還具有與化合物結合的能力等等。
2.4 中藥靶點作用網絡的繪製和驗證
隨著蛋白質相互作用研究技術(包括酵母雙雜交、 GST 標記 pull-down、免疫共沉澱、親和色譜、表面等離子共振等)的發展, 目前已經獲得了大量的蛋白質-蛋白質相互作用數據。目前較大的蛋白質相互作用資料庫有(1) BIND (The Biomolecular Interacfion Network Database) 數 據 庫 (http://bind.ca/)。該資料庫包含了所有生物分子例如蛋白質、 DNA、 RNA、配基、複合體、基因還有一些未分類的生物實體的相互作用數據。 BIND 的數據來源包括期刊提交、公眾提交、文獻提取、其他蛋白質相互作用資料庫導入等; (2) DIP 資料庫 (http://dip.doe-mbi.Ucla.edu/), 專門存放實驗確定的蛋白質之間相互作用的數據, 既包括經典實驗手段確定的蛋白質相互作用, 也包括高通量實驗手段確定的蛋白質相互作用數據; (3) STRING 資料庫, 與 BIND、DIP 數 據 庫 不 同 的 是 , STRING 數 據 庫 (http://string.emb1.de)不僅存儲實驗確定的蛋白質相互作用數據, 它還存放預測得到的蛋白質相互作用數據,並對各種預測方法得到的結果的準確性給出了相應的權重。
在獲得化合物的直接蛋白質靶點(通過生物信息學預測並驗證)信息和可能蛋白質靶點(通過比較蛋白質組學比較對照和給予化合物後蛋白質表達譜的變化)信息的基礎上, 可以利用蛋白質-蛋白質相互作用資料庫, 繪製出化合物的靶點作用網絡。例如, 本實驗室就用該方法繪製了靈芝酸 D 的靶點作用網絡。對於網絡中的一些預測的中間蛋白質,可以再進行深入研究, 用生物學實驗(如 RNA 幹擾、基因過表達等)進行驗證。繪製靶點作用網絡的方法可能對於中藥的研究有特別適合之處, 因為中藥往往是同時對多個靶點發生作用, 而對每個靶點的作用都不是很強。因此, 只有從網絡的角度才可以獲得對中藥作用機制的比較全面的了解。
2.5 中藥複方可能協同作用機制的研究
中藥複方是在中醫理論指導下的中醫臨床用藥的主要形式, 也是中藥有別於植物藥或草藥而具有的特色所在。藥有個性之特長, 方有合群之妙用。「君臣佐使」的組方原則, 「相須、相使、相惡」的作用規律, 是傳統中醫藥學整體觀和辯證論治的集中體現。只有充分研究揭示中藥複方的物質基礎和作用機理, 促進中藥的現代化和用於指導新的中藥的開發, 才是對我國寶貴的中醫藥最好的繼承和發揚。中藥複方中各單方之間的相互作用機制的揭示是中藥研究的關鍵。筆者所在實驗室進行了一些將蛋白質組學用於複方作用機制研究的嘗試。例如, 我們在分別研究丹參總酚酸和三七總皂苷的可能作用靶點的同時也對丹參和三七的複方配伍機制進行了探索性研究。蛋白質組學用於複方研究的可能研究思路有：
2.5.1 生物信息學分析可能發生協同作用的靶點蛋白質或信號通路
在獲得關於複方中各單方的可能蛋白質靶點的信息後, 我們可以用生物信息學的方法尋找可能發生協同作用的機制。產生協同作用的可能性包括： (1) 不同單方作用於同一蛋白質靶點, 在與該蛋白質的結合中具有協同作用。關於這一點, 可以通過分析不同單方化合物對於同一蛋白質的結合位點等進行研究; (2) 不同單方作用於不同蛋白質靶點, 但是這些蛋白質屬於同一信號通路的不同組成部分, 因此單方之間存在著信號通路層面的協同作用。關於這一點, 可以通過將不同單方的蛋白質靶點在信號通路資料庫中找到它們參與的信號通路後進行分析。
目前, 筆者所在實驗室正在用這些方法進行丹參三七的分析工作, 對於丹參, 我們選取了其中代表性的化合物丹酚酸 B、紫草酸、迷迭香酸、丹參素四種化合物進行分析; 對於三七, 我們選取了其中代表性的化合物三七皂苷及其兩種體內代謝產物進行分析, 目前已經獲得了一些初步的結果(待發表)。
2.5.2 聚類分析單方和複方影響的蛋白質表達譜
在蛋白質組學研究時, 如果同時進行各單方和複方的研究, 就可以獲得各單方及複方各自影響的蛋白質表達譜。通過比較分析這些表達譜, 可以獲得一些對複方作用機制的了解。例如, 筆者所在實驗室用大鼠心肌缺血再灌注損傷模型考察了丹參、三七、和丹參三七複方的藥理作用及各處理組動物心臟的蛋白質表達譜。在此模型中丹參三七複方的藥效作用優於單獨運用的丹參或三七。蛋白質組學的分析結果顯示, 如果對與缺血再灌注損傷最為相關的多個蛋白質在各處理組進行聚類分析, 丹參、三七單用能夠不同程度地調節缺血再灌注導致的異常蛋白質表達; 與單方相比, 丹參三七複方能夠使異常的蛋白質表達譜回到最接近假手術對照組的水平。這些結果提示蛋白質表達譜的變化和藥效是吻合的, 蛋白質表達譜可以反映複方優於單方的特點(待發表)。
中藥複雜體系的研究需要以中醫藥傳統的理論體系為指導, 藉助現代生物醫學的研究方法, 通過多技術輔助、多視角切入、多學科滲透交叉, 才能夠全面、系統、正確地闡明中藥尤其是複方的作用靶點、作用環節和作用過程。將系統生物學的理論與方法學引入中藥的研究領域已經初步顯示了其可行性與合理性, 「系統生物學能夠給中藥研究帶來突破」這一觀念已經成為中藥研究者的共識。蛋白質組學是目前系統生物學領域的研究熱點, 蛋白質組學在中藥複雜體系研究中的應用無疑給中藥的研究帶來很大的發展空間。本文綜述了一些將蛋白質組學應用於中藥研究的成功實例和目前的一些研究思路。可以預計, 隨著蛋白質組學自身的發 展 , 蛋 白 質 組 學 在 中 藥 復 雜 體 系 的 研 究 中一定還會有更多的用途。另外, 要強調的是, 蛋白質組學只是系統生物學的組成部分之一, 很多研究者用系統生物學的其他技術平臺如基因組學、代謝組學等也都取得了很好的研究成果。因此, 筆者認為在中藥複雜體系的研究中最好綜合應用多種系統生物學關鍵技術和手段, 把多種手段獲得的結果進行融合, 只有這樣才能夠真正發揮系統生物學的優勢, 建立與中醫整體理論相符的整體研究思路, 從分子水平上闡明中藥複雜體系的物質基礎和作用機理, 為中藥的現代化和國際化服務。
版權聲明：本文來源於《中醫藥中青年科技創新與成果展示論壇 》, 2009。中藥大品種聯盟（BBTCML）編校發布。作者：劉 璇, 嶽慶喜, 果德安。編輯：遠志。轉載請標註作者及出處。