糖基化分析

糖基化分析

上次麥哥說要發布一個重要的專題，從今天開始，我們正式進入這一專題：糖基化分析。給大家帶來滿滿的乾貨，希望你們能從中有所收穫。

一、糖基化簡介

生物製藥領域主要的研究對象是蛋白，蛋白的翻譯後修飾（PTM，post translational modification）有很多種，例如磷酸化、糖基化、甲基化、乙醯化等。糖基化修飾是蛋白質中最廣泛和功能最多樣的翻譯後修飾，真核生物體內約50%的蛋白質發生糖基化修飾。

許多蛋白的糖基化與疾病的發生、發展具有密切的關係，例如糖尿病免疫系統疾病、神經系統疾病及癌症等。抗體類的糖基化更是對生物藥物的活性以及半衰期有著直接或者間接的影響，甚至影響到抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity）和補體依賴的細胞毒性作用(Complement-dependent cytotoxicity，CDC)。FDA已經批准的用於癌症疾病診斷和監控的生物標誌物中大部分是糖蛋白，用於癌症治療的生物藥物中很多也是含有糖基化的蛋白。

糖基化通常由內質網中開始，然後在高爾基體中完成最終的修飾。參與糖基化修飾的糖類主要是六碳己糖（Hexose），包括葡萄糖（α-D-glucose，Glc）、半乳糖（β-D-galactose，Gal）、甘露糖（α-D-mannose，Man）、N-乙醯葡糖胺（β-D-N-acetyl-glucosamine，GlcNAc）、N-乙醯半乳糖胺（α-D-N-acetyl-galactosamine，GalNAc），巖藻糖（α-L-fucose，Fuc）、唾液酸（α-Sialic acid，SA）等。

糖基化中常見的單糖

（Challenges of glycosylationanalysis and control: an integrated approach to producing optimal andconsistent therapeutic drugs[J]. Drug Discovery Today, 2016, 21(5):740-765.）

在這裡麥哥補充一點關於單糖構型的知識，後面用到的時候不會讓大家感覺突兀。己糖通常會有D型和L型以及α和β之分。D型和L型是Fisher投影式中，位號最大，離羰基最遠的手型碳原子的羥基在右側為D型，在左側的為L型。由於Fisher投影式為平面結構，實際上的己糖都是成環結構，故後來形成了Haworth投影式。在Haworth投影式中，位於1號碳原子上的羥基與4號碳原子上的羥基在同側的是α構型，在異側的是β構型。其中，1號碳原子上的羥基為己糖的還原端，4號碳原子上的羥基為非還原端。還原端可以和我們常用的標記試劑2-AA、2-AB、2-AP等進行偶聯。

Fisher投影式

Haworth投影式

糖蛋白上連接的糖鏈通常分布不均一，且結構多種多樣，有單鏈的也有分支結構的，常常表現出糖基化的為不均一性。糖基化通常分為N型和O型糖基化，O型糖基化中又有O-GalNAc糖基化和O-GlcNAc糖基化兩種形式。

二、糖基化的分類

2.1 N糖基化

N糖基化在細胞內的合成

（Essentialsof Glycobiology. 3rd edition. Chapter 9 N-Glycans）

N-糖基化生物合成分兩個階段，分別位於在真核細胞的兩個細胞器內，即ER和高爾基體進行。第一階段是一個高度保守的途徑，在ER膜上的脂質載體DOL-P上進行。第二階段開始於內質網內糖基化酶和糖基轉移酶對N-聚糖的加工，並以物種、細胞類型、蛋白質甚至位點特異性的方式在高爾基體中繼續進行。上圖詳細描述了N糖基化的形成過程，首先在酶的催化作用下，寡糖與DOL-P形成一個脂多糖前體（dolichol pyrophosphateN-acetylglucosamine ，Dol-P-P-GlcNAc）。脂多糖前體在ER內側的寡糖基轉移酶（OTS的作用下，會被錨定到新生蛋白保守序列Asn-X-Ser/Thr中的Asn上（X為除Pro外的任意胺基酸）。之後在酶的作用下對糖鏈進行初步修飾，形成Man8的高甘露糖型，並對蛋白進行摺疊，隨著ER中的囊泡轉移到高爾基體的內側（Golgi）。從順勢高爾基體中（cis-Golgi）進入，經過中間囊膜（medial-golgi），最後從反式高爾基體(trans-Golgi)中出來的整個過程中，在各種酶的修飾下，甘露糖不斷被剪切，其他單糖不斷增加，最後就形成了成熟的糖基化蛋白。在這一過程中，許多糖苷酶和糖基轉移酶會根據細胞的生理狀態進行差異化的表達，因此成熟的糖基化蛋白所攜帶的N糖基化類型取決於細胞中的糖苷轉移酶類型以及細胞的生理狀態。此外，高爾基體內還有一條N糖基化蛋白降解途徑，磷酸化的N糖基化蛋白切除GlcNAc，生成被Man-6-P受體（M6PR）識別的Man-6-P，M6PR最終將糖蛋白轉移到溶酶體中進行消化降解。

N糖基化通常包含一個五糖核心結構，由連接在Asn上的GlcNAc和延伸的GlcNAc以及3個Man組成。Man形成支鏈結構，後面還可以增加Man、GalNAc、以及SA（Neu5Ac/ Neu5Ga）等，與Asn連接的GlcNAc有可能會增加一個Fuc修飾。經過不同的修飾後，N糖基化基本形成3種不同構型，分別是高甘露糖型（Oligomannose）、複雜型（complex）和雜合型（hybrid）。高甘露糖型自五糖核心開始向後的糖鏈延伸均為甘露糖。複雜型糖型自五糖核心開始向後的糖鏈延伸可以是GlcNAc、GalNAc、Gal、SA等，但五糖核心外的第一個延伸己糖不能是Man。雜合型糖型自五糖核心開始向後的糖鏈延伸一部分是高甘露糖型，一部分是複雜型。

N糖基化的3種構型

2.2 O糖基化

O糖基化修飾分為O-GlcNAc糖基化和O-GalNAc糖基化。

O-GlcNAc糖基化在O-GlcNAc糖基轉移酶（O-GlcNAc transferase，OGT）的催化作用下單個O-GlcNAc以O-糖苷鍵連接至蛋白質的Ser或Thr殘基的側鏈羥基上的過程，該糖基化僅含有O-GlcNAc一個己糖修飾，不含有側鏈分支。

O-GalNAc糖基化是指寡糖鏈以還原端的O-GalNAc通過α-糖苷鍵連接Ser或Thr殘基的側鏈羥基的糖基化形式。O-GalNAc糖基化發生在內質網後期或高爾基體中，首先在酶的催化作用下，N-GalNAc從UDP-GalNAc轉移至Ser或Thr側鏈羥基上，形成「Tn」抗原結構。該結構是基礎的O-GalNAc糖鏈，隨後經過其他糖苷轉移酶的修飾，將不同的己糖添加至O-GalNAc的末端，形成不同核心結構的O-GalNAc糖鏈。

O-GalNAc糖基化修飾共有8種核心結構，比N糖基化的5糖核心結構要複雜的多，其中人體內主要有Core1-Core4共4種核心結構。

O-GalNAc糖基化4種核心結構的合成

三、糖基化的分析策略

未完待續。。。